Az ABCA1 fehérje sejtfelszíni expresszió változásainak vizsgálata

Az ABCA1 fehérje a koleszterin-anyagcsere egy kulcsfontosságú szereplője, mivel a reverz koleszterin transzport kezdeti lépésében, a koleszterin és az apoA-I kölcsönhatásában, a nascens HDL előállításában játszik meghatározó szerepet. A rendelkezésre álló adatok alapján nem teljesen világos, hogy maga az ABCA1 a koleszterin transzporter vagy más fehérjéket szabályozva segíti elő a transzportfolyamatot. Szintén vitatott kérdés, hogy az apoA-I koleszterinnel való feltöltése a sejtfelszínen történik vagy a sejten belül reciklizáló endoszómákban. Mindenesetre az apoA-I megkötése biztosan a sejtfelszínen zajlik, mely folyamatban az ABCA1 kulcsszerepet játszik, hiszen funkcióvesztéssel járó mutációi (pl. a Tangier betegségben) HDL-deficienciához és a koleszterin-anyagcsere zavaraihoz vezetnek.

Az ABC transzportereket általában tekintve, csak kevés olyan ellenanyag létezik, amely a fehérje külső felszínéhez köt. A legtöbb ezek közül ráadásul több epitópot keresztkötő, konformáció-szenzitív antitest (pl. 5D3 anti-ABCG2 ellenanyag). Még az olyan nagy külső hurkot tartalmazó ABC fehérjék ellen, mint az ABCA alcsalád tagjai, sem áll rendelkezésre megfelelően szenzitív és szelektív külső felismerésű ellenanyag. Mivel az ABCA1 működésé-nek megértéséhez kulcsfontosságú a fehérje sejtfelszíni detektálása, a következőkben ismertetett munkánk célja az volt, hogy egy olyan kísérleti eszközt hozzunk létre, amely lehetővé teszi az ABCA1 funkcionális expressziójának szenzitív követését a sejtfelszínen.

28. ábra: Az ABCA1 címkézése extracelluláris hemagglutinin (HA) epitóppal és a Walker A mutációk elhelyezkedése a polipeptidláncon belül. Az ABCA1 feltételezett membrántopológiáján feltüntettük a HA-epitóp pozícióját, amely az első külső hurok elején helyezkedik el (207-es pozíció). Mindkét nukleotid-kötő domén (NBD) Walker A motívumában kicseréltünk egy kritikus lizint metioninra: K939M, illetve K1952M.

Jelölések: MK - a fehérje N-terminális felében egyetlen mutációt tartalmazó variáns; KM – az ABCA1 C-terminális felében mutáns változat; MM – dupla mutáns.

Ennek érdekében egy hemagglutinin (HA) epitópot helyeztünk be az ABCA1 fehérje első, külső hurkába, a 207-es pozícióba (28. ábra). A funkcionális vizsgálatokhoz létrehoztunk olyan mutáns variánsokat is, amelyeket korábbi munkáinkban sikeresen alkalmaztunk más ABC fehérjéknél. Így a nukleotid-kötő doménekben lévő Walker A motívumban a kritikus lizint metioninra cseréltük, létrehozva két egyes mutánst, a K939M (MK) és K1952M (KM) variánst, illetve egy dupla mutánst (MM). Ezeket a mutánsokat is HA-címkével láttuk el.

Retrovírus expressziós rendszer segítségével többféle emlős sejtvonalat (HEK293, MDCKII, HeLa) transzdukáltunk a különböző ABCA1 variánsokkal. Majd különböző szelekciós, szétválogatós (sorting) és klónozási eljárásokkal erőfeszítéseket tettünk arra, hogy a transzgént stabilan expresszáló sejtvonalakat hozzunk létre. Az irodalomból ismert volt, hogy az ABCA1 expresszió hamar lecseng a transzfektált/transzdukált sejtekben.

Törekedtünk arra, hogy közepes, az endogén rendszerekkel összevethető expressziós szinteket állítsunk be az egyes sejtvonalaknál. Kvantitatív RT-PCR-rel ellenőriztük, hogy a HA-címkézett ABCA1 variánsok mRNS szintje hasonló az LXR-indukált makrofágokban tapasztalható értékekkel (ábrán nem bemutatott eredmény, 10. sz. közlemény 2a ábra).

Sikerült létrehoznunk olyan HEK293, illetve MDCKII sejtvonalakat, amelyek stabilan, 20, illetve 50 passzázson keresztül expresszálták a HA-címkézett ABCA1 variánsokat. A teljes fehérje expressziót Western blot analízissel követtük (29a ábra), az ABCA1 variánsok sejtfelszíni megjelenését pedig nem-permeabilizált sejteken végzett immunfestést követően áramlási citométerrel határoztuk meg (ábrán nem bemutatott eredmény, 10. sz. közlemény 3. ábra). Mindkét módszer esetében kereskedelmi forgalomban kapható, a HA-epitópot specifikusan felismerő, nagy érzékenységű ellenanyagot használtunk a bevitt fehérje-variánsok detektálására.

Megvizsgáltuk, szintén anti-HA ellenanyagot alkalmazva, a HA-címkézett ABCA1 variánsok sejten belüli elhelyezkedését. Különböző szubcelluláris markereket használva, HEK293 sejteken megmutattuk, hogy a bevitt fehérje mind a vad típusú, mind a mutáns változataiban elsősorban a plazmamembránban lokalizálódik (29b ábra). Valamennyi festődést láttunk a Golgi apparátusban és csekély mértékűt az endoszómákban (ábrán nem bemutatott eredmény, 10. sz. közlemény 4. ábra). MDCKII sejteken azt is demonstráltuk, hogy polarizáltan növesztve a sejteket, a HA-címkézett ABCA1 variánsok a bazolaterális membránban helyezkednek el (ábrán nem bemutatott eredmény, 10. sz. közlemény 5. ábra), ami megegyezik azzal, amit korábban leírtak a címke nélküli ABCA1 szubcelluláris lokalizációjáról. Összességében a fehérje expresszió és lokalizáció az általunk létrehozott sejtvonalakban minden tekintetben megfelelt az elvárásoknak.

29. ábra: A HA-ABCA1 variánsok stabil expressziója és jellemzése. a) HA-címkézett vad típusú (HA-VT), K939M mutáns (HA-MK), K1952M mutáns (HA-KM), valamint dupla mutáns (HA-MM) ABCA1-gyel transzdukált HEK293 és MDCKII sejtek teljes sejtlizátumából készült mintákon Western blot analízissel ellenőriztük a fehérje expressziót 20-50 passzázson keresztül, anti-HA ellenanyagot használva. Az ábra az 5.

passzázs utáni állapotot mutatja. Negatív kontrollként az üres vektorral transzdukált sejteket (vektor), felviteli kontrollként a Na⁺/K⁺-ATPázt használtuk. b) Anti-HA ellenanyaggal vizsgáltuk a címkézett fehérje sejten belüli lokalizációját transzdukált HEK293 sejteken, konfokális mikroszkópot használva (zöld). Plazmamembrán markerként jelölt búzacsíra agglutinint (WGA) használtunk a sejtek enyhe fixálása után, de a sejtek permeabilizálása nélkül (piros). c) ApoA-I-függő koleszterin kiáramlást mértünk a HA-címkézett, illetve címke nélküli, vad típusú ABCA1-et expresszáló HEK293 és MDCKII sejteken. Negatív kontrollként a kiindulási (parentális) sejtvonalakat használtuk. n.d. - nem detektálható. Az alsó panelek mutatják a fehérje expressziókat anti-ABCA1 ellenanyaggal készült Western blotokon.

A következő kérdés az volt, hogy vajon a bevitt HA-epitóp a fehérje funkcióját befolyásolja-e. Ennek felderítése érdekében megmértük az általunk létrehozott sejtvonalakban a sejtfelszíni apoA-I kötést (ábrán nem bemutatott eredmény, 10. sz. közlemény 6b ábra), valamint a sejtekből történő apoA-I-függő koleszterinkiáramlást (29c ábra), és összevetettük a címke nélküli ABCA1-gyel kapott értékekkel. Eredményeink azt mutatták, hogy az ABCA1 ezen funkcióit a HA-epitóp bevitele nem érintette.

Mivel munkánk célja az ABCA1 sejtfelszíni expressziójának detektálására alkalmas kísérleti eszköz létrehozása volt, a következőkben megmutattuk, hogy a létrehozott sejtvonalak – elsősorban a HA-ABCA1 variánsokat expresszáló HEK293 sejtek – alkalmasak az ilyen jellegű vizsgálatokra. Rendszerünk validálására olyan anyagokat használtunk, amelyek irodalmi adatok alapján mind pozitív, mind negatív irányba képesek befolyásolni az ABCA1 sejtfelszíni expresszióját.

30. ábra: Különböző anyagok az ABCA1 sejtfelszíni expressziójára gyakorolt hatása. A HA-címkézett vad típusú ABCA1-gyel (HA-VT) (a), illetve a K939M/K1952M dupla mutánssal (HA-MM) (b) transzdukált HEK293 sejteket különböző anyagokkal 4 órán át előkezeltünk, majd anti-HA ellenanyaggal, nem-permabilizált sejteken végzett immunfestést követően áramlási citométerrel határoztuk meg a sejtfelszíni expressziókat. Az elpusztult sejteket propidium-jodid festés alapján zártuk ki. A kapott eredményeket az oldószerrel előkezelt sejtekhez (kontroll) viszonyítottuk. Jelölések: ALLN – 50 μM acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinál; BFA – 5 mg/ml brefeldin A; apoA-I - 10 μg/ml apoA-I; CsA – 10 μM ciklosporinA; EZ – 50 μM ezetimib. Az oszlopok átlag ± SEM értékeket mutatnak (n > 3), a csillagok a kontrollhoz viszonyított szignifikáns különb-ségeket jelölik (p < 0,005), n.s. – nem szignifikáns.

Mivel ismert, hogy az ABCA1 lebontásában közreműködik a kalpain cisztein-proteáz, ezért ennek gátlásával várhatóan növelni lehet a fehérje sejtfelszíni expresszióját. Ennek megfelelően az acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinál (ALLN), ami egy kalpain inhibitor, a mi rendszerünkben is emelte a HA-ABCA1 szintet a plazmamembránban (30. ábra). A brefeldin A (BFA) pedig azáltal, hogy gátolja a membránfehérjék transz-Golgiból való továbbjutását, a várakozásnak megfelelően csökkentette az ABCA1 sejtfelszíni megjelenését. Ennek a két anyagnak a hatása az ABCA1 funkciójától független, és ezzel összhangban kísérleti rendszerünkben mind a vad típusú, mind a mutáns változat expresszióját megváltoztatta.

Ezzel szemben az apoA-I csak a vad típusú ABCA1 sejtfelszíni expresszióját növelte, mivel a kölcsönhatásuk ismerten funkció-függő [114].

Miután ismert hatású anyagokkal meggyőződtünk tesztrendszerünk használhatóságáról, a továbbiakban megvizsgáltuk számos olyan anyag - az ABCA1 variánsok sejtfelszíni expressziójára gyakorolt hatását, melyekről azt tartják, hogy egymagukban vagy kombinációban alkalmazva in vivo csökkentik a koleszterinszintet. Ezek között szerepelt az atorvasztatin, ezetimib, niacin, a kálcium-csatorna blokkoló nifedipin és a verapamil.

Vizsgálatunk célja az volt, hogy kiderítsük, hogy esetleg ezek a szerek részben vagy teljesen az ABCA1 expressziójának módosítása révén fejtik-e ki hatásukat. Emellett tanulmányoztunk olyan anyagokat is, amelyekről más kísérleti rendszerekben kimutatták, hogy befolyásolják az ABCA1 fehérje plazmamembrán szintjét és működését. Ilyenek pl. a ciklosporin A (CsA), amelyről azt írták le, hogy „becsapdázza” a fehérjét a sejt felszínen [115], vagy a gliburid, amely több ABC fehérjével együtt képes gátolni az ABCA1 működést [116, 117]. Az ABCG2 függő működését látva (ld. 4.2.2. fejezet), megvizsgáltuk a koleszterin-depléciónak, illetve a membrán koleszterinnel való töltésének az ABCA1 sejtfelszíni megjelenésére gyakorolt hatását is.

Mivel a legtöbb vizsgált anyag érdemben nem befolyásolta az ABCA1 variánsok sejtfelszíni expresszióját, ezek részletes ismertetésére a jelen disszertációban nem térek ki (ld.

10. közlemény 1. táblázat). Két vegyületet azonban érdemes itt is megemlíteni. Azt tapasztaltuk, hogy a CsA mind a vad típusú, mind a mutáns HA-ABCA1 expressziós szintjét megemeli a plazmamembránban (30. ábra), ami egyrészt összhangban áll korábbi irodalmi adatokkal, másrészt újdonságként megmutatja, hogy ez az effektus nem a fehérje funkciójához kapcsolódik. A másik új és meglepő eredmény, hogy az ezetimib, a koleszterin bélből való felszívódását gátló gyógyszer, csökkentette a vad típusú HA-ABCA1 sejtfelszíni expresszióját, de nem befolyásolta a mutáns variáns plazmamembrán szintjét. Jelen vizsgálataink ugyan nem adnak magyarázatot az ABCA1 és az ezetimib kölcsönhatásának mechanizmusára, de felhívják a figyelmet arra, hogy ennek a farmakonnak az eredeti támadáspontján kívül más hatása is tapasztalható. Ráadásul a két effektus, a koleszterin-felszívódás gátlása és az ABCA1 szintjének csökkentése, a szervezet szintjén ellentétes hatást eredményez. Ezért ez a megfigyelésünk – és hasonló jövőbeli vizsgálatok eredménye - felhasználható lehet a tudatos gyógyszermolekula tervezéseknél.

Összefoglalva, a jelen bemutatott munkánk során sikerült létrehozni egy olyan kísérleti rendszert, amely segítségével érzékenyen, megbízhatóan és reprodukálható módon lehet vizsgálni az ABCA1 funkcionális jelenlétét a plazmamembránban. Vizsgálataink az ezetimib példáján keresztül arra is rávilágítottak, hogy bizonyos gyógyszermolekulák – esetleg az eredeti támadásponttól függetlenül – befolyásolhatják az ABCA1 sejtfelszíni megjelenését, és ezzel a koleszterinháztartásban betöltött szerepét.

4.4. Az ABC transzporterek védőhálója a szervezetben