Klasszikus ökotoxikológiai tesztek

A Klasszikus ökotoxikológiai tesztmódszereket kemikáliák önmagukban történő kockázatelemzésére fejlesztették ki. Később az így kidolgozott módszerek kerültek alkalmazásra természetes minták esetében is. Ezek a tesztek jellemzően egyfajú tesztek, melyek végpontja akut esetben leggyakrabban a tesztorganizmus túlélése, ill. valamely ehhez szorosan kötődő élettani jellemző. Ez a jellemző lehet például mortalitás (immobilitás), vagy növekedés-gátlás (pl. növényfajok, fitoplankton esetében) (Robinson és Thorn 2005).

Mivel a toxicitás faj és vegyület specifikus jellemző, a vizsgálatok során célszerű több fajból álló, ún. battery-tesztrendszert alkalmazni. Természetes minták vizsgálata esetében fontos szem előtt tartani, hogy a vizsgált biótára jellemző fajok kerüljenek kiválasztásra a vizsgálatok kivitelezésére, melyek megfelelően reprezentálják az egyes trofikus szinteket (LeBlanc 2004).

A konvencionális módszerek többnyire szabványok által meghatározott módon kerülnek alkalmazásra. A legelterjedtebben az OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development), ISO (International Organisation for Standardisation), valamint az ASTM (American Standards for Testing Materials) által kiadott szabványokat alkalmazzák a laboratóriumok (1. táblázat). A standardizált módszerek közös előnye, hogy a megfelelően definiált eljárásoknak köszönhetően a különböző laboratóriumok által kapott eredmények jól összehasonlíthatóak. Hátrányuk, hogy az újabb eljárások és tesztszervezetek szabványosítása időigényes folyamat, így a korszerűbb eljárások csak kisebb-nagyobb időbeli csúszással jelenhetnek meg. Ezen felül a standardizált eljárások sem teljesen zárhatják ki az emberi szubjektivitást.

17 1. táblázat. A OECD, ISO és ASTM szabványok által alkalmazott tesztszervezetek.

Trofikus szint Faj Szabvány

Lebontók Vibrio fischeri ISO 11348-1-2-3:2007

Eleveniszap mikroorganizmusai ISO 15522:1999 OECD Test No. 209 Földigiliszta-félék

Eisenia foetida/andrei OECD Test No. 222

Eisenia fetida OECD Test No. 207

ASTM E1676 - 04

ISO 11268-1:1993-2:1998-3:1999 Televényféreg

Enchytraeus sp. OECD Test No. 220

ASTM E1676 - 04 Elsődleges termelők

Zöld alga fajok

Scenedesmus subspicatus OECD Test No. 201 Chlorella vulgaris

Gonyaulax polyhedra ASTM E1924 - 97(2004) Brakkvízi alga fajok

Ceramium tenuicorne ISO 10710:2010 Békalencse fajok

Lemna minor ISO 20079:2005 OECD Test No. 221 Lemna gibba ASTM E1415 - 91(2004)e1

OECD Test No. 221 Szárazföldi növények OECD Test No. 208, 227

ASTM E1963 - 09 Elsődleges

fogyasztók

Édesvízi kisrák fajok

Daphnia magna ISO 6341:1996, 10706:2000 OECD Test No. 202, 211 ASTM E1193 - 97(2004) Ceriodaphnia dubia ISO 20665:2008

ASTM E1295 - 01(2006) Tengeri kisrák fajok

Acartia tonsa ISO 14669:1999 ASTM E2317 - 04 Tisbe battagliai

Nitocra spinipes Árvaszúnyog-félék

Chironomus tentans OECD Test No. 218 / OECD Test No. 219 Chironomus riparius

ISO 7346-1-2-3:1996, 10229:1994, 15088:2007, 12890:1999, OECD Test No. 203-204, 210, 215, 219, 220, 229-230

ASTM E1711 - 95(2008), E729 - 96(2007), E1022 - 94(2007), E1192 - 97(2008)

18 1.1.2. Alternatív ökotoxikológiai tesztek

Az ökotoxikológiában használatos alternatív módszereket igen nagy sokféleség jellemzi. Ez a sokféleség adódik részben a vizsgálandó környezeti elemek sokféleségéből, részben pedig a potenciális stresszorok, xenobiotikumok diverzitásából.

Környezetszennyezőnek olyan anyagok nevezhetőek, melyek meghatározott koncentráció felett és kémiai formában megterhelést jelentenek az ökoszisztéma biotáira, káros, vagy toxikus hatásuk által.

A xenobiotikumok és a környezeti minták sokfélesége egy sor ún. mikrobioteszt kifejlesztéséhez vezetett, mint a Microtox (a Vibrio fischeri bakteriális biolumineszceciáján alapuló teszt), az Algaltoxkit (mikroalga teszt Raphidocelis subcapatia fajon), a Daphtoxkit, a Thamnotoxkit és a Rotoxkit (Pesoone 1998). A felsorolt módszerek mindegyike a mortalitást használja végpontkén. A tesztek fő előnye, hogy a mortalitás mérése viszonylag precíz, gyors és olcsó, főként mivel nem szükséges törzstenyészetek fenntartása (Rand és Petrocelli 1985).

Ugyanakkor a szubletális végpontú tesztek is fontos szerepet játszanak az ökotoxikológiában. A szubletális végpontot vizsgáló eljárásokat három fő csoportra oszthatjuk: (1) biokémiai és fiziológiai tesztek (pl. enzimatikus és respirációs tesztek), (2) viselkedéstani vizsgálatok (pl. lokomóciós vizsgálatok, és (3) hisztológiai vizsgálatok (pl. testszövetek elváltozásainak vizsgálata) (Rand és Petrocelli 1985;

Mitchell, et al. 2002).

Az ökotoxikológia területén alkalmazott alternatív módszerek az alábbi csoportokba sorolhatóak (Jamie és Ingrid 1999):

 In vivo módszerek, ezen belül o Haltesztek

o Rovar tesztek o Zooplankton tesztek o Makrofita tesztek o Mikrobiális tesztek

 In vitro módszerek:

o Biokémiai, immunológiai módszerek o Enzimatikus tesztek

19 o Immunológiai (ELISA) módszerek

o Sejtvonalakon végzett tesztek 1.1.2.1. In vivo módszerek

Az in vivo módszerek közös sajátossága, hogy nem alkalmazhatóak önmagukban specifikusan toxikus összetevők behatárolására, hanem összesített, kumulatív toxicitás meghatározására alkalmasak.

1.1.2.1.1. Hal tesztek

Különböző halfajokat elterjedten alkalmaz az ökotoxikológia mint modellorganizmust, nem csak különböző anyagok környezeti kockázatának meghatározására, de a hatásmechanizmusok feltérképezésére is. Mivel a szennyező anyagok koncentrációja gyakran szubletális tartományba esik, számos módszer került kifejlesztésre az egyed alatti szintű kockázat meghatározására. A haltesztek elsősorban a különböző fejlődési stádiumú egyedek viselkedéstani, hisztológiai, molekuláris biomarker és endokrin rendszerbeli változásokra fókuszálnak (Domingues et al. 2010).

A halfajok közül az egyik legelterjedtebben alkalmazott tesztorganizmus a Danio rerio.

A faj alkalmazásának előnye, hogy megfelelő érzékenységgel használható vegyi anyagok széles skálájának kockázatbecslése során. Ezen kívül könnyen kivitelezhetőek a fajon embrionális vizsgálatok, mivel: (1) nagyszámú és kis méretű ikrát produkál, így lehetőség nyílik kis mennyiségű minták vizsgálatára (akár 24 lyukú mikropléten is); (2) az ikrák áttetszőek, így a szervek fejlődése könnyen figyelemmel kísérhető az első 48 órában; (3) szubletális végpontok széles skálája alkalmazható a tesztek során, mint például fejlődéstani, és biomarker változások (Oliveira et al. 2009). További pozitívuma a faj alkalmazásának, hogy megfelelő korreláció figyelhető meg a korai fejlődési stádiumú és a felnőtt egyedek reakciói között. Így például kálium-dikromátra a felnőtt egyedek 112.76 ± 26,66 mg/l, míg a korai stádiumú (megtermékenyített ikrák) 362.42 ± 108,6 mg/l LC₅₀(96h) értékkel reagálnak (Domingues et al. 2010).

További, a D. rerio fajhoz hasonlóan elterjedten alkalmazott fajok a Cyprinus carpio és az Oncorhynchus mykiss. Számos szubletális végpontú teszt kivitelezhető ezen taxonok felnőtt és embrió stádiumú egyedein is (Sanchez és Porcher 2009). A D. rerio fajhoz hasonlóan viselkedéstani, fejlődéstani és biomarker vizsgálatokra is van lehetőség. Az

20 O. mykiss érzékenysége kálium-dikromátra LC50= 28.5 mg/l, míg a C. carpio LC50= 61 mg/l körül adódik (96h) (Svecevicius 2007; Vutukuru et al. 2007).

Számos halfaj reakcióit vizsgálták cianotoxinok kapcsán. A tesztek végpontja a mortalitás mellett kiterjedt az embriófejlődés során bekövetkező anomáliákra, rheotaxis vizsgálatára, enzimatikus változásokra, hisztopatológiai vizsgálatokra, valamint a táplálékszelekció képességére. A legkiterjedtebben vizsgált fajok a Danio rerio, Cyprinus carpio, Oncorhynchus mykiss. Az expozíciós mód leggyakrabban az orális és a hasüregi injektálás.

Cyprinus carpio orális expozíciója esetén a mikrocisztin-LR már 550 μg/kg dózis mellett halálosnak bizonyult, melyet a máj károsodása okozott (Rabergh et al. 1991).

Mivel azonban ezek a vizsgálatok sem az expozíciós út, sem pedig ökológiai szempontból nem nevezhetőek relevánsak, ezt követően a kísérletek elsősorban vízben oldott komponensekre irányultak. Korai fejlődési stádiumú Cyprinus carpio egyedeken a neurotoxikus anatoxin-a már 160 μg/l-es koncentráció és 9 órás expozíciós idő mellett is jelentős mortalitást okozott. Ugyanilyen koncentráció mellett 5 napos expozíció hatására 75 %-os kelési arány csökkenést okozott. Ugyanakkor az is bebizonyosodott, hogy hasonló toxintartalmú nyers algakivonat szignifikánsan nagyobb hatást fejt ki, mint tisztított toxin önmagában (Osswald et al. 2009).

Danio rerio rheotaxis-vizsgálata során már 0,5 és 5 μg/l-es mikrocisztin koncentráció szignifikáns viselkedésbeli változást okozott. Ugyanakkor az 5 μg/l koncentráció felett jelentősen csökkent a szaporodás-aktivitás is (Baganz et al. 1998). Ugyanezen faj embrionális fejlődése kapcsán feljegyezték, hogy hasonló mikrocisztin-LR koncentráció (5-50 μg/l) a kezelés során nem okozott megfigyelhető elváltozást. Azonban a kezelt embriókat toxinmentes környezetbe áthelyezve jelentősen csökkent az embrió fejlődés üteme és a túlélési arány (Oberemm et al. 1997). Cilindrospermopszin nem okozott jelentős mortalitást D. rerio embrionális vizsgálata kapcsán. Azonban az embriókba injektálva az LD50érték 4.50 fmol CYN/embrióra adódott (Berry et al. 2009).

1.1.2.1.2. Rovar tesztek

Az ökotoxikológia számos rovarfajt és ezek különböző stádiumú lárváit alkalmazza a toxikus anyagok kockázatbecslése során. Ezek között számos szúnyogfaj és lárvái megtalálhatóak. Mind a felnőtt, mind pedig a lárvák egyedein gyakran végeznek

21 biomarker, fejlődési, lokomóciós és mortalitás vizsgálatokat. A leggyakrabban alkalmazott fajcsoport, a Chironomus sp. érzékenysége kálium-dikromátra 11,8 és 112,9 mg/l LC₅₀ (48h) közé esik (Khangarot és Ray 1989; Meister 1995; Choi és Roche 2004;

Choi et al. 2001).

További elterjedten vizsgált a faj a sivatagi sáska (Schistocerca gregaria) (McElhiney és Lawton 2005) és a gyümölcslégy (Drosophila melanogaster) (Kaya et al. 2002). A fajok egyedein elsősorban mortalitási, genetikai és biomarker vizsgálatokat végeztek.

Az alternatív tesztek ezen csoportja a legkevésbé releváns, ha cianobakteriális toxicitás jelentette kockázat felmérését tekintjük. Ez részben nehézkes kezelésüknek, részben csekély ökológiai relevanciájuknak köszönhető, főként, ha azt vesszük figyelembe, hogy elsősorban nem vízi rovarokat vizsgáltak. A különböző rovarfajokon jellemezően akut toxicitási vizsgálatokat végeztek.

A vízi rovarok közül különböző szúnyogfajokat és ezek lárváit tanulmányozták (Turell és Middlebrook 1988). A lárvák vizsgálata elsősorban nem a cianobakteriális toxicitás meghatározására, hanem a cianotoxinok, szúnyogirtó szerként történő alkalmazhatóságának lehetőségére terjedt ki. A kifejlett egyedeket injekciózták, a lárvákat pedig oldatba helyezték a kísérletek során. Microcystin-RR esetében a sárgaláz vektor faja az Aedes aegypti érzékenysége LC₅₀ =14,9 mg/l-re adódott (Kiviranta et al.

1992). A Westiellopsis sp. cianobactérium LC50 értéke Aedes aegypti 55.84mg/l, Anopheles stephensi 38.45 mg/l, Culex quinquefasciatusra 14,25 mg/l, Culex tritaeniorhynchusra 6.3 mg/l (Rao et al. 1999). Microcystis aeruginosa fajjal szemben a C. quinquefasciatusra és A. stephensi lárvák LC50 értéke 8 és 15 mg/l között adódott (Dhananjaya et al. 2003). Egy neuro- és hepatotoxinokat nem termelő Oscillatoria agardhii faj az A.aegypti különböző fejletségi szintű lárváira 8,7 és 6,1 mg élő sejt/l közötti LC50 értéket mutatott (Kiviranta és Abdel-Hameed 2004). A módszer megfelelő érzékenységet mutatott, de az organizmusok kezelésének bonyolultsága okán mégsem terjedt el alkalmazásuk.

Egy további rovarfaj, melyen kísérleteket végeztek a gyümölcslégy (Drosophila melanogaster) volt. Ezeket az állatokat könnyű kezelni, nem igényelnek különleges felszerelést. A toxinokat orális úton juttatták be a tesztszervezetekbe, szűrőlapocskákra cseppentett, répacukorban oldott formában, és a 24 óra alatt elpusztult egyedeket

22 számlálták. Sajnos a módszer nem mutatott kellő érzékenységet a neurotoxikus Aphanizomenon fajokkal szemben (Swoboda et al. 1994).

Tanulmányozták a sivatagi sáska (Schistocerca gregaria) fajt is, mint potenciális alternatívát. A módszer megfelelő érzékenységet mutatott bizonyos cianobakteriális toxinokra és törzsekre (Aphanizomenon flos-aquae LD50= 60 mg/kg; Anabaena aphanizomenoides LD50= 170,2 mg/kg; Cylindrospermopsis raciborskii LD50=131.4 mg/kg; LD50=15 mg/kg Microcystis aeruginosa 60 mg/kg Aphanizomenon flos-aquae;

170,2 mg/kg Anabaena aphanizomenoides; 131,4 mg/kg Cylindrospermopsis raciborskii; (15 mg/kg) Microcystis aeruginosa, microcystin-LR LD50 = 130 mg/kg. ) (Hiripi et al. 1998; J. McElhiney et al. 1998). Egy további vizsgálat alapján azonban, a módszer nem mutatott megfelelő érzékenységet szaxitoxinokra (LD50 = 554-914 μg/100 g) Ez az eljárás sem terjedt el szélesebb körben.

1.1.2.1.3. Zooplankton tesztek

A szakirodalom tekintélyes részét képezi a fajcsoporttal kapcsolatos vizsgálatok.

Számos taxonon végeztek a témakörben vizsgálatokat, melyek közt megtalálhatóak édes- és sósvízi fajok egyaránt, előbbiek közül több hazánkban is őshonos. Ezek a fajok fontos tagjai a vízi ökoszisztémáknak, hiszen a zooplankton elsődleges fogyasztóként számos magasabb rendű fajnak szolgál táplálékául.

A tesztek során a stresszor által kiváltott és vizsgált válasz, a mobilitás-gátlási (gyakorlatilag mortalitási) arány, a táplálkozás aktivitás gátlása, mozgási és légzési aktivitás csökkenése. Számos standardizált változata létezik az ilyen típusú vizsgálatoknak, illetve több faj hozzáférhető a kereskedelemben úgynevezett tox-kitek formájában, melyek tartalmazzák a vizsgálatok elvégzéséhez szükséges tesztszervezeteket tartóspete formájában, a keltetéshez szükséges oldatokat, valamint a szükséges eszközök többségét. Ezen körülményeknek, illetve a tesztszervezetek könnyű kezelhetőségének köszönhetően a toxikológiában, ökotoxikológiában igen elterjedt módszerekről van szó (Pesoone 1998).

Az egyik legelterjedtebb ezen kisrákok közül talán a sórák, vagy sóféreg (Artemia salina), mivel könnyen hozzáférhetőek, egyszerűen tarthatóak, és a tesztek kivitelezéséhez nem szükségesek különleges eszközök. A sórákot hosszú ideje használják környezetszennyező anyagok hatásának vizsgálatára, standardizált ún.

teszt-23 kitek formájában is forgalmazzák. A tesztek során 24 órás expozíciós idejű mortalitási arányt vizsgálhatunk (Nunes et al. 2006). Az Artemia salina kálium-dikromátra adott válasza (EC50; 24h) 91 és 126 mg/l között adódik (MacLean és Doe 1989).

Jó érzékenységet mutat a módszer különböző cianotoxinokkal szemben: mikrocisztinek:

LD₅₀ = 5–10 mg/l (McElhiney és Lawton 2005; Metcalf et al. 2002), cilindrospermopszin: LC50= 2,86 mg/l (Metcalf, et al. 2002), anatxin-a: 2-14 mg/l (Laht, et al. 1995), ugyanakkor az is bebizonyosodott, hogy a módszer jól korrelál az egér toxikológiai vizsgálatok eredményeivel (Kiviranta et al. 1991; Metcalf, et al. 2002).

Hasonlóan elterjedten használják a Daphnia fajokat alkalmazó módszereket. Ezen fajok közül sok nálunk is őshonos, így nagy relevanciával bír a hazai ökotoxikológiában. A Daphnia fajok különösen alkalmasak mikrocisztinek vizsgálatára, a sórákhoz hasonló mortalitás teszteken keresztül. (Baird et al. 1989) A Daphnia fajokon alapuló kitek szintén elérhetőek a kereskedelemben. A Daphnia magna érzékenysége kálium-dikromátra 0.6–2.1 mg/l közé esik (Persoone et al. 2009).

A Daphnia fajok érzékenysége a cianobakteriális toxinokkal szemben hasonló az Artemia salina fajhoz. Három Daphnia faj (D. pulicaria, D. hyalma, D. pulex) vizsgálata alapján a Mikrocisztin-LR 48 órás EC50 értéke 9,6 és 21,4 mg/l közé, míg 24 órás vizsgálat esetén 10,7 és 50 mg/l közé esik. Ezek közül a D. pulex bizonyult a legérzékenyebbnek. (DeMott et al. 1991). D. magna esetében az LC50 értékek 0,6- 1,26 mg/l (24h) értékek közé esnek (Lindsay et al. 2006; Kim et al. 2003). Ugyanakkor mikrocisztin tartalmú cianobaktériumok nyers kivonataira D. pulicaria és D. similis fajok 36 – 162,45, illetve 34,2 – 1380 mg/l LC50 értéket mutattak (Jungmann és Benndorf 1994; Sotero-Santos et al. 2006; Okumura et al. 2007). Egy kísérletsorozatban D. pulex 10 klónján M. aeruginosa cianobaktérium nyers kivonatának vizsgálata 0,022 és 2,61 mg/l közötti LC50 (48h) értékek adódtak (Hietala, et al. 1997). Ezek az adatok azt mutatják, hogy nemcsak különböző Daphnia fajok között, de akár a klónok között is jelentős eltérések adódhatnak a cianotoxinokra (Dao et al. 2010).

Számos szubletális hatásról számol be a szakirodalom cianotoxinok hatásával kapcsolatban. Így például számos Microcystis faj (Nizan et al. 1986; Henning et al.

1991; Lotocka 2001; Rohrlack et al. 2001) kapcsán a táplálkozás aktivitás csökkenéséről, illetve ezen túlmenően, Cylindrospermopsis raciborskii és

24 Aphanizomenon ovalisporum fajok kapcsán az emésztőrendszer károsodásáról és ezen keresztül közvetlen toxikus hatásról számolnak be a szerzők (Nogueira et al. 2006).

Proteáz inhibitor szekunder metabolitok kapcsán (pl. microviridin J) a vedlési folyamat zavarát jegyezték fel. Bár az új kültakaró kialakult, az állatok képtelenek voltak a régitől megszabadulni, e közben a még lágy héj oly mértékben deformálódott, hogy végül az állatok pusztulását okozta (Rohrlack et al. 2004) .

Egy további, az Amerikai kontinensen őshonos kisrák, mely a kereskedelemben, teszt kitként forgalomban van, a Thamnocephalus platyurus. Ez a taxon is kellően érzékenynek mutatkozott egy sor toxinnal szemben (Törökné et al. 2000). A standard mortalitás teszten felül, lehetőség van úgynevezett táplálkozási aktivitás teszt kivitelezésére is, mely szintén standardizált és validált eljárás. Ennek előnye, hogy gyorsabb a mortalitási teszteknél, illetve szubletális végpontot vizsgál (Törökné et al.

2007). A T. platyurus érzékenysége kálium–dikromáttal szemben (LC50; 24h) 0,11 és 0,18 mg/l közé esik (Fochtman et al. 2000).

A legnagyobb számú irodalmi hivatkozás a mikrocisztin típusú toxinok és az ezeket termelő algafajok hatásának vizsgálatával kapcsolatos. Tisztított mikrocisztinekre 3,6-8,6 mg/l (24h) (Blom et al. 2001), valamint 0.1-2.27 mg/l (1h táplálkozás aktivitás teszt) LC₅₀ értékek adódnak (Törökné 1999). Hasonlóan érzékeny a tesztszervezet mikrocisztin tartalmú cianobaktériumok nyers kivonataira is, a toxintartalommal azonban az eredmények nem mindig korrelálnak (Törökné et al. 2007; Keil et al. 2002).

1.1.2.1.4. Makrofita tesztek

Makrofita növényeken végzett vizsgálatok során általában a növekedési aktivitás gátlás alapján lehet következtetni a vizsgált minta toxikus hatására. Az ilyen típusú vizsgálatoknál azonban sokkal nagyobb jelentőséggel bírnak és jóval elterjedtebbek az in vivo jellegű enzim vizsgálatok.

A vizsgálatok során talán legelterjedtebben használt faj a kis békalencse (Lemna minor).

Ez a faj könnyen hozzáférhető, könnyen tartható laboratóriumi körülmények között és könnyen hozható létre belőle törzstenyészet. A módszer hátránya ellenben, hogy a standard kísérleti eljárás meglehetősen hosszadalmas, egy hétig tart (OECD 2002).

További, a békalencséhez hasonló, gyakran vizsgált faj, a vízi dara (Wolffia arrhiza), mely hasonlóan használható, mint a már említett békalencse. Mindkét faj megfelelő

25 érzékenységet mutat toxinokkal szemben (Mitrovich et al. 2005; Mitrovic et al. 2004).

A L. minor IC₅₀=10 és 30 mg/l értékek között adódik kálium-dikromátra (7 nap) (Merlin et al. 1993).

Lemna minor és Wolffia arrhiza mirocisztin-LR 10 és 20 mg/ml hatására 5 nap expozíciós idő jelentős növekedés-gátlást és tömegcsökkenést eredményez. Ezen felül L. minor esetében megfigyelték a peroxidáz enzim aktivitásának szignifikáns növekedését is (Mitrovich et al. 2005). Ezzel párhuzamosan Microcystis aeruginosa allelopátiás válaszokat váltott ki Lemna japonica fajon (Jang et al. 2007), ugyanakkor hasonló elváltozásokat Lemna gibba nem produkált (LeBlanc et al. 2005).

További, elterjedten vizsgált faj a közönséges nád (Phragmites australis). A vizsgálatok során a növények biomassza produkcióját, illetve növekedési ütemét határozzák meg.

Gyakran vizsgált paraméter a gyökér növekedésének üteme is. 0,5 mg/l mikrocisztin-LR koncentráció felett 50 %-nál magasabb növekedés-gátlást figyeltek meg 5-20 napos expozíciós idő mellett. Ugyanakkor szignifikáns hatást váltott ki két napos expozíciós idő mellett már 1 mg/ml mikrocisztin-LR koncentráció is (Máthé, et al. 2009).

Hasonló módon alkalmazott, faj a fehér mustár (Synapis alba). E faj vizsgálata során is a növények, vagy a magok (csíranövények) növekedési ütemét vizsgálják. A különböző mikrocisztin variánsok e növényre kifejtett inhibíciós hatása (IC50) 1,6-7,7 mg/l közé esik (McElhiney et al. 2001).

1.1.2.1.5. Mikrobiális tesztek

A legtöbb figyelmet kapott eljárás, a Microtox, amelynek tesztszervezete a mélytengeri biolumineszkáló baktérium, a Vibrio fischeri. A toxicitás mértéke a Microtox esetén az által válik mérhetővé, hogy a baktériumok által kibocsátott fény mennyisége csökken a mérgező vegyületek hatására. A fényintenzitás csökkenéséért a luciferáz enzim működésének gátlása a felelős. (Bulich 1979).

Az előzetes vizsgálatok azt mutatták, hogy ez a rendszer alkalmas lehet a mikrocisztinek gyors detektálására algamintákban. Ám a részletes vizsgálatok eredménye az volt, hogy az eljárás olyan mikrocisztintől eltérő anyagokra is érzékeny, melyeket tartalmaznak az algakivonatok, és eddig még nem sikerült azonosítani (Campbell et al. 1994). Mára számos olyan publikáció napvilágot látott, melyek egyértelműen azt mutatják, hogy nincs korreláció a Microtox eljárás által adott

26 eredmény és a sejtek cianotoxin tartalma között (Vezie et al. 1996). Mikrocisztinekre a módszer EC50 értéke 0,02 és 0,46 mg/l közé esik (Lawton et al. 1990; Aboal et al. 2002;

Volterra et al. 2006). Nodularinra a módszer kevésbé érzékeny, érzékelési határa 250 mg/l (Dahlmann et al. 2001).

A másik eljárás, melyet vizsgáltak, a Serratia marcescens pigment-termelésének (prodigiozin) gátlásán alapul. Ez az eljárás alkalmasnak mutatkozott szaxitoxinok és mikrocisztinek detektálására, de hasonlóan a Microtox teszthez, ez az eljárás is túl gyengén korrelált az aktuális minta cianotoxin tartalmával (Dierstein et al. 1989;

Lawton et al. 1994).

1.1.2.1.6. In vivo enzimatikus módszerek

Az in vivo enzimatikus vizsgálatok jó felvilágosítást adnak az élő szervezetben toxikus hatásra lejátszódó hatásokról. Az eljárásokkal általában azt vizsgáljuk, hogy az élőlény (lehet állati, vagy növényi szervezet) mely enzimjei gátoltak/aktiválódnak működésükben bizonyos mérgező anyag hatására. A gátolt enzim fajtája felvilágosítást ad egyrészt, hogy milyen hatásmechanizmus szerint hat az adott toxin, másrészt, a kérdést megfordítva, pontosítani lehet, hogy milyen típusú, minőségű anyagok okozzák a toxikus hatást.

A tejsavdehidrogenáz (LDH) aktivitásban bekövetkezett változás vizsgálatát széles körben alkalmazza mind a toxikológia, mind pedig a klinikai kémia sejt, szövet és szervkárosodások diagnosztizálására. Az LDH fontos glikogén enzim, mely szinte az összes szövetben előfordul, ezért elterjedten alkalmazott eljárássá vált az ökotoxikológia területén is. (Diamantino et al. 2001).

Az LDH-szint változása, elsősorban a sejtek, szövetek épségének jelzője. Megbízható, gyors és egyszerűen kivitelezhető (Decker és Lohmann-Matthes 1989). Széles körben használják, sokféle sejtvonalon pl.: HepG2 sejteknél (Dong et al. 1989), PC 12 sejtek (Satpute et al. 2008), RBE-4 endothel sejteknél (Price et al. 2006), de primer patkány kortikális neuronokon történő mérésre is van példa (Akasofu et al. 2006). Szövetek, magasabb rendű élőlények esetében egésztest/szövet homogenizátum, illetve vér alkalmas a vizsgálat céljára.

Számos esetben alkalmazták cianotoxinok hatásának becslésére, többnyire más enzimek együttes vizsgálatával mind sejtvonalakon (Pichardo et al. 2005; Dias et al.

27 2009; Botha et al. 2004), halakon (Rabergh et al. 1991), rágcsálókon (Ding et al. 1989;

Gehringer et al. 2004), makrogerinctelen fajokra (Dewes et al. 2006) és zooplanktonra (Chen et al. 2005).

A glutation S-transzferáz (GST) a detoxifikációs folyamatok indukciójának markere, mely fontos szerepet játszik a szervezetbe került xenobiotikumok metabolikus folyamataiban. A GST a glutation –SH csoportjának konjugációját katalizálja számos toxikus elektrofil komponensre, ezáltal semlegesítve és vízoldékonyabbá téve azt (Habig és et al. 1974).

A GST aktivitást elsősorban a hepatotoxikus összetevőkkel (mikrocisztinek és nodularinok) kapcsolatban vizsgálták, hiszen metabolízisük ezen az enzimrendszeren keresztül megy végbe mind emlősökben (Kondo et al. 1992), vízi gerincesekben (Pflugmacher et al. 1998, Wiegand et al. 1999) és vízi gerinctelenekben (Vinagre et al.

2002; Beattie et al. 2003; Chen és Xie 2005; Pflugmacher et al. 2005). Ezen felül bebizonyosodott, hogy anatoxin-a hatására növényekben megnő a peroxidáz- és GST-aktivitás (Mitrovic et al. 2004).

Az acetilkolinészteráz (AChE) az állatok szervezetének idegi működése során keletkező egyik neurotranszmitter anyag, az acetilkolin lebontását végzi. Optimális körülmények között az enzim az acetilkolint acetátra és kolinra bontja, gátlása esetén az acetilkolin felhalmozódik és blokkolja a neurotranszmissziót (Purves et al. 2004).

A módszer elsősorban anatoxinok és anatoxin-a(S) detektálására alkalmas. Az

A módszer elsősorban anatoxinok és anatoxin-a(S) detektálására alkalmas. Az

In document Alternatív ökotoxikológiai tesztek környezetszennyező komponensek detektálására (Pldal 15-0)