Biokémiai marker vizsgálatok Artemia salina héjnélküli kisrákon

legfontosabb marker enzimek alakulása alapján is értékeltük. Az akut expozíció során a tesztállatokban a glutation-S transzferáz (a detoxifikációs folyamatok indukciójának markere), a tejsav dehidrogenáz (a metabolikus állapot mutatója), valamint az acetilkolineszteráz (neurotranszmisszió jelzője) enzimaktivitás változásait vizsgáltuk.

A teszteket sórákon (Artemia salina) azzal a céllal végeztük, hogy részletesen nyomon tudjuk követni a nyers algakivonatok dózisfüggő hatását a kontroll és az LC50-es szintnek megfelelő koncentráció tartományban.

A mortalitási tesztek alapján legtoxikusabb AQS törzs nyers kivonata jelentős LDH aktivitásnövekedést okozott (0,2 mg/ml kezelési koncentrációnál a kontroll érték háromszorosát) (11. ábra és 6. táblázat).

Az ACT 9504, ACT 9502 és PCC 6506-ös törzsek kivonatai általánosan a kontroll érték 2,5- szeresét jelentő LDH aktivitásnövekedést szintén előidéztek. Az LDH aktivitás maximális szintjét az ACT 9504 és PCC 6506 törzsnél 1 mg/ml kezelési koncentrációnál mértük, míg az ACT 9502 törzsnél 2 mg/ml koncentrációnál. Az ACT

68 9503 és ACT 9505 törzsek kivonatai mintegy 2-szeres LDH aktivitásnövekedést a 3 mg/ml kezelési koncentrációnál fejtettek ki a sórák naupliákban.

11. ábra. Tejsav dehidrogenáz aktivitásának változása a sórák naupliákban a nyers cianobaktérium kivonatok hatására

Az AQS törzs kivonatával ellentétben valamennyi balatoni Cylindrospermopsis raciborskii ill., a PCC 6506-os törzs nyers kivonata szignifikáns GST aktivitásnövekedést okozott a kezelés során, mely dózisfüggően nőtt az LC50 expozíciós küszöbig (12. ábra).

Az ACT 9504 és ACT 9502 törzsek kivonatával kezelt rákokban a GST aktivitás mintegy 80%-al volt nagyobb a kontroll szintnél, míg az ACT 9503 és ACT 9505 törzsek kivonata kisebb mértékű (45-, ill. 30%), de ugyancsak szignifikáns növekedést okozott. A PCC 6506-os törzs közel azonos mértékű GST aktivitásnövekedést fejtett ki, mint a balatoni ACT 9504 és ACT 9502 törzsek. Az AQS törzs nyers kivonata GST aktivitás gátlást (0,2 mg ml^-1 kezelési koncentrációnál 50% a kontrollhoz mérten) váltott ki a tesztállatokban, ami az AQS törzs által termelt cilindrospermopszin sajátos

kezelési koncentráció [mg alga ml^-1]

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

69 cianobaktériumok által termelt hatóanyagok neurotoxikus hatását jelzik. Az AQS, valamint az ACT 9503 és ACT 9505 törzsek kivonatai nem váltottak ki szignifikáns hatást az acetilkolineszteráz aktivitásra (13. ábra).

A biokémiai marker enzimek dózisfüggő változása alapján probit analízissel meghatároztuk az algakivonatok 50%-os hatáskoncentrációit, melyek alapján megállapítható, hogy a balatoni Cylindrospermopsis raciborskii törzsek toxikus jellegükben illetve hatásmechanizmusuk szerint az anatoxinokat termelő PCC 6506-ös törzshöz állnak közelebb.

kezelési koncentráció [mg alga ml^-1]

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

70

kezelési koncentráció [mg alga ml^-1]

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

A tesztsorozat célja a három általánosan alkalmazott biokémiai biomarker, az LDH, a GST, valamint az AChE rutinszerű alkalmazhatóságának vizsgálata volt az ökotoxikológia vizsgálatok során.

71 Az LDH citoplazmatikus eredetű enzim, amely számos szövet sejtjeiben jelen van. Az LDH enzimnek fontos szerep jut a sejtek energiaellátásában, különösen, ha gyors energia utánpótlásra van szüksége a sejteknek. Negatív korreláció figyelhető meg a vízi élőlények LDH aktivitása és az elérhető oxigénmennyiség között, amely egy lehetséges biokémiai kiegyensúlyozó folyamatra utal alacsony oxigénszint esetén (Wu és Lam 1997). Az anaerob metabolitikus folyamatok felerősödése világos jelzője az oxigénhiány hatására létrejövő energiahiányos állapotnak (Van DerThillart 1986).

Halak esetében például peszticidek károsító hatására a károsodó kopoltyúk nem képesek ellátni feladatukat az oxigénfelvétel során (Lichtenfels et al. 1996). Hasonlóan, propanil hatására létrejövő anémiás állapotban az anabolikus és katabolikus metabolitikus folyamatok kerülnek előtérbe (McMillan et al. 1990; McMillan et al. 1991).

Ez a folyamat kémiai stressz hatására is aktivizálódik, amikor a szervezetben nagyobb energiaigény indukálódik a toxikus komponensek ártalmatlanítása érdekében. Az energianyerés ilyenkor anaerob glikolízis útján megy végbe. Ezért az LDH aktivitásának vizsgálata vízi gerinctelenek esetében megfelelő eljárás toxikus hatások detektálása (Diamantino et al. 2001). A cianobakteriális toxicitás hatásainak vizsgálatában az LDH-t mint toxicitási végpontot, szinte kizárólag sejtkultúrára épülő in vitro tesztekben alkalmazzák (Botha et al. 2004; Humpage et al. 2005; Dias et al. 2009).

A széles körben alkalmazott ökotoxikológiában azonban gyakran alkalmazott végpont (Das és Jena 2004; Sancho et al. 2009), egyebek mellet a kémiai stresszor által indukált energiaprodukció folyamatbeli változásainak nyomon követése során például Daphnia magna (De Coen et al. 2001), közönséges géb (Pomatoschistus microps) (Monteiro et al. 2006; Vieira et al. 2008) fajokon vizsgálták az in vivo LDH aktivitás változását.

Az általunk tapasztalt GST aktivitás gátlást jegyeztek Lindsay et al. (2006) Artemia salina sórák naupliáknál cilindrospermopszinnal történő expozíció során. A szerzők 1μg/ml CYN koncentráció mellett szignifikáns GST aktivitás csökkenést tapasztaltak. A CYN toxinról irodalmi adatokból tudjuk, hogy toxikus hatását csak akkor képes kiváltani, ha a citokróm P450 metabolizáló rendszer aktiválódik (Runnegar et al. 1995;

Shaw et al. 2000). Ha a citokróm P450 rendszer károsodik, vagy telítődik, a CYN nem képes hatását kifejteni, ezért telítődési értéket követően csökken a GST aktivitás (Lindsay et al. 2006). A GST rendszer elsősorban a hepatotoxikus xenobiotikumok detoxifikációjában játszik fontos szerepet, de kisebb mértékben egyéb toxikus anyag

72 szervezetbe jutása is befolyásolja aktivitásának mértékét (Pflugmacher et al. 1998;

Pflugmacher és Steinberg 1998; Pflugmacher et al. 2001; Beattie et al. 2003).

Lindsay et al. (2006) cianobakteriális LPS hatására is szignifikáns GST aktivitás csökkenést regisztráltak. Hasonlóan GST inhibíciót figyeltek meg cianobakteriális LPS hatására Danio rerio fajon Runnegar et al. (1995) is. A balatoni törzsek, valamint a PCC 6506 jelentősen kisebb hatását ez utóbbi tény magyarázza, illetve a GST aktivitás kisebb mértékű változása hepatotoxinok hiányára utal. Az általunk leírt haranggörbe alakú telítési mintát írtak le Veira et al. (2009) higany hatásainak vizsgálata kapcsán közönséges géb esetében (Pomatoschistus microps). A szerzők a telítődési minta megjelenését a GST enzim toxin által történt felélésének tulajdonítja, melyhez hasonló jelenséget tapasztaltak fekete törpeharcsa (Ictalurus melas) vizsgálata kapcsán (Elia et al. 2003) is.

Az AChE klasszikus biomerkere a neurotoxikus hatásoknak, általában szerves foszfát- és karbamát peszticidek hatásának leírására alkalmazzák. Ugyanakkor számos egyéb fontos szennyező anyag típussal kapcsolatban, mint például fémek, szénhidrogének és detergensek vizsgálata során is leírtak AChE gátló hatást (Zinkl et al. 1991; Payne et al.

1996; Najimi et al. 1997; Guilhermino et al. 1998).

A hepatotoxikus nodularinnal (cianotoxin) kapcsolatban szintén leírtak AChE gátló hatásokat Macoma balthica kagylófaj vizsgálata kapcsán. A szerzők ezt egyfelől a nodularin általános toxikus hatásából fakadó idegi elváltozásokkal magyarázzák.

Másfelől feltételezik, hogy a toxikus folyamatok hatása által a szövetekben kiváltott megnövekedett energiaigény gátló hatással van a proteinszintézisre, ezen belül az AChE szintézisre és a szervezetben jelenlévő mennyiségre is (Lehtonen et al. 2003).

Vizsgálataink során szignifikáns AChE inhibíciót a nagymennyiségben citotoxikus és protein szintézist gátló cilindrospermopszint tartalmazó AQS törzs hatására nem tapasztaltunk, bár ez a törzs bizonyult a legtoxikusabbnak valamennyi mortalitási teszt során. Ez nem támasztja alá Lehtonen et al. (2003) következtetését az AChE közvetett gátlására vonatkozólag. Ugyanakkor szignifikáns AChE gátló hatást váltottak ki a balatoni C. raciborskii ACT 9502 és ACT 9504 törzsek, valamint az anatoxinokat termelő PCC 6506 törzs. Ez a gátló hatás azonban nincs összefüggésben az anatoxinok mennyiségével, mivel az analitikai vizsgálatok nem mutatták anatoxinok jelenlétét

73 egyik balatoni C. raciborskii törzs esetében sem (3.5 fejezet). Mindamellett az anatoxin-a és a homoanatoxin-a hatását nem a kolinészteráz enzim blokkolása révén, hanem a muszkuláris és idegi nikotin acetilkolin típusú receptorok antagonisztikus gátlása által fejti ki. Specifikus AChE gátlást csak az anatoxin-a(S) vált ki az anatoxinok közül (Araoz et al. 2009; Osswald et al. 2007). A vizsgálatok során az AChE aktivitás a bevitt algamennyiséggel negatív korrelációt mutatott. A korreláció arra utal, hogy mind a PCC 6506, mind a balatoni ACT 9502 és ACT 9504 C.

raciborskii törzsek tartalmazhatnak ismeretlen AChE inhibitor szekunder metabolitokat.

3.4.4. Biokémiai marker vizsgálatok Dikerogammarus villosus amphipoda