Algakivonatok

A kísérletek során 6 algatörzset teszteltünk. Négy, a Balatonból izolált C. raciborskii törzset (ACT 9502, ACT 9503, ACT 9504, ACT 9505); toxikus referenciaként a bizonyítottan cilindrospermopszint termelő ausztrál Cylindrospermopsis raciborskii (AQS), valamint a norvég, anatoxinokat termelő Oscillatoria sp. (PCC 6506) törzset. Az alga kivonatokat azonos módon és időben állítottuk elő, illetve teszteltünk.

A cianobaktériumok fél-folyamatos tenyésztése 16 literes üveg hengerben történt. A tenyészetet BG-11-es médiumban tartottuk fent (Rippka et al. 1979). A C. raciborskii tenyészetekhez NaNO3 mentes médiumot használtunk. Az alga kultúráinkat folyamatosan ellenőrzött körülmények között szaporítottuk 22±1°C-on, 14:10 órás fény:sötét ciklus mellett (a sugárzás mértéke 80 μmol m-2 s-1,(US-SQS/L spherical microsenzor, WALZ), melyet egy hidegfény fluoreszcens lámpatest biztosított (Tungsram F-33, 40 W). A kései exponenciális növekedési fázis elérése után a sejtek összegyűjtése GF/C szűrőpapíron (Watman) keresztüli centrifugálással történt. A médiummentes alga biomasszát lefagyasztottuk -20°C fokon, majd liofilizáltuk. A kivonat készítéséig a szárazanyagot –20°C-on tároltuk. Az algák feltárását desztillált vízben több ciklusú fagyasztás/kiolvasztás útján végeztük. A feltárás hatékonyságát mikroszkópban ellenőriztük. A sejttörmeléket két ciklusban, centrifugálással távolítottuk el (12000g, 10 perc, 4°C).

44 2.2. Vizsgálatok Lemna minor makrofita növényen

2.2.1. Növekedési inhibíció teszt

A teszt kivitelezése az OECD Test No. 221 Lemna sp. Growth Inhibition Test (2006) alapján történt. A békalencse-növekedés gátlásának vizsgálata, a Svéd szabványnak megfelelő növekedési közegben (SIS) történt. A tesztnövényeket a szabványban meghatározott módon létrehozott altenyészeteiből nyertük.

A teszt kivitelezése során folyamatos, fehér fényű, 6000-10000 lux intenzitású megvilágítást alkalmaztunk. A hőmérséklet 24±2 °C (szobahőmérséklet), az expozíciós idő pedig 7 nap volt. A hígítási sorok készítése során a tápoldatot használtuk a tesztoldatok hígítására. Az expozíció 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokban zajlott, melyekbe 150 ml mintát helyeztünk, valamint 10 darab kétlevelű Lemna minor egyedet.

A kontrol médiumként a fent leírt módon készült tápoldatot használtuk.

Az expozíciós idő letelte után feljegyeztük a levélkék számát, a levélkeszámok természetes alapú logaritmusából (lnF) meghatározható a növekedési sebesség (µ). Ezen µ értékeket először a tesztedényekre vonatkozóan számítottuk, majd a párhuzamosokra vonatkozóan átlagoltuk. Ebből meghatároztuk az egyes hígításokhoz tartozó növekedési sebességi értékeket.

µ=(lnFt–lnF0)/t, ahol:

Ft: az edényben lévő levélkeszám t idő elteltével F₀: az edényben lévő levélkeszám a kísérlet kezdetén t: kísérlet közben eltelt idő

A békalencsén végzett kísérletek során fontos paraméter a duplázódási idő (TD), melyet a növekedési sebességből határoztunk meg.

TD= ln2/µ

A növekedési sebesség ismeretében annak százalékos gátlása számolható (%Ir) minden egyes hígítás esetén:

%Ir=(µk-µt)*100/µk,

45 ahol:

µk: a kontroll növekedési sebessége

µt: a mintában lévő növény növekedési sebessége

A százalékos gátlás ismeretében számolható az EC50 érték.

2.2.2. Képelemzési módszeren alapuló Lemna minor teszt

A tesztek kivitelezése ez esetben azonos volt az előzőekben (Vizsgálatok Lemna minor makrofita növényen) leírtakkal. A levélkeszám helyett azonban a növekedés ütemének meghatározása érdekében a növények felületéről készült fotók szoftveres értékelése alapján került sor. Speciálisan ehhez a feladathoz fejlesztettük ki a Duckweed Detector (DwD) v0.1/v.02 szoftver, amely a felület vizuális becslését végzi. A programmal meghatározható mind az élő, mind a halott levélkék által fedett terület teljes vizsgálati területhez viszonyított százalékos aránya.

Az eljárás algoritmusa a következő:

1. A békalencse-tenyészetet alulról fehér fénnyel megvilágítottuk, majd felülről lefényképeztük.

2. A képet színsávokra bontottuk. A kiértékeléshez célszerűen a piros vagy a kék sávot vizsgáltuk. (A háttérfény fehér, tehát tartalmaz kék, zöld, és vörös komponenst is. Ez azért fontos, mert a kamera CCD-je ezt a három sávot méri a színes kép előállításához. Ahol a fény (majdnem) akadály nélkül jut a kamerába (üvegen, a folyadékon vagy az elpusztult levélen keresztül), ott mindegyik sávból jut át fénymennyiség. A sötétzöld részeken viszont csak némi zöld fény jut át.)

3. Kijelöltük a vizsgálati területet. A DwD módot ad arra, hogy egy célkereszt mozgatásával mi jelöljük ki a vizsgált terület közepét, majd ehhez a kör sugarát a pixelek számának megadásával határozhatjuk meg.

4. Beállítottuk az érzékenységet, tehát definiáltuk az élő és a halott levélkékhez tartozó vágási küszöböt. Ezzel meghatároztuk, melyek azok a képpontok, amelyek elég sötétek (a kék csatornában), ezeket tekintjük élőnek.

5. Megkaptuk az élő, illetve a halott levélkék által borított terület nagyságát a vizsgálati terület százalékában.

46 Az így kapott százalékos értékeket az előzőekben leírt számítási algoritmusba helyettesítve határoztuk meg a növekedési-gátlás mértékét.

2.3. Vizsgálatok Daphnia magna plankton rákon 2.3.1. Daphnia magna immobilitás teszt

A MicroBioTests Inc.-től szereztük be a tesztszervezeteket tartósított formában tartalmazó DAPHTOXKIT F^TM –et, amely tartalmazza a keltetéshez és a teszteléshez szükséges eszközöket (mikroplétek, pipetták, Petri csészék) és anyagokat (sóoldatok NaHCO3, CaSO4, MgSO4, KCl, melyekből a teszt során alkalmazott standard édesvíz készíthető). A tesztek kivitelezése az MSZ EN ISO 6341:1998 szabványnak megfelelően történt.

A tesztek kivitelezése során a kittben található pléteket alkalmaztuk, hígító és kontrol közegként pedig az előlevegőztetett standard édesvizet használtuk. A kísérletek során három párhuzamos mérést alkalmaztunk minden esetben. A megfelelő hígítási arányok beállítását követően 10-10 ml teszt oldatba 5-5 tesztállat került. A feltöltött mikropléteket 20 °C-ra beállított inkubátorba helyeztük 24 óra (expozíciós idő) erejéig.

24 óra elteltével meghatároztuk a mortalitási arányt.

2.3.2. Daphnia magna táplálkozás aktivitás-gátlás teszt

A Daphnia magna táplálkozásaktivitásán alapuló eljárás saját fejlesztés. A módszer alapja egy hasonló, Amerikában őshonos héjnélküli kisrák fajra (Thamnocephalus platyurus; Rapidtoxkit, MicroBioTests, Belgium) kidolgozott eljárás, mely során a lárvákat rövid idejű expozícióját követően (15-60 perc), színes jelölőanyaggal „etetik”

be. A jelölő anyag az aktívan táplálkozó egyedek emésztőrendszerében mikroszkóp segítségével megfigyelhető. A teszt végpontja a táplálkozásaktivitás csökkenése.

A miropléteket a mortalitási teszttel azonos módon feltöltve, majd 20 °C-on, egy, két, illetve négy órás expozíciós idő elteltével 0,1 ml piros színű polisztirén mikrogyöngyök szuszpenzióját adagoltunk a tálca celláiba. A mikrogyöngyök átmérője 5μm, melyet akadálytalanul képesek a tesztállatok felvenni (Burns 1968). Újabb fél órát követően a tesztegyedeket fixáltuk, majd mikroszkóp tárgylemezére pipettáztuk. A fénymikroszkóp tárgyasztalára kék színű fényszűrőt helyeztünk (így könnyebben megkülönböztethetőek

47 a piros anyagot elfogyasztó egyedek azoktól, amelyek nem táplálkoztak) és meghatároztuk azon egyedek számát, melyek emésztőrendszerét kitölti a jelölőanyag.

2.4. Thamnocephalus platyurus mortalitás teszt

A tesztek kivitelezése a Daphnia magna immobilitás teszt eljárás során alkalmazott kitthez hasonló, Thamnotoxkit F kit felhasználásával történt. Ennek tartalma hasonló a Daphtoxkit F-hez, valamint a standard oldat elkészítése is megegyezik. Fontos különbség azonban, hogy a tesztállatok keltetéséhez szükséges idő ez esetben 24 óra. A vizsgálatokat az MSZ 20359:2003 (Környezetvédelmi ökotoxicitás-vizsgálatok Thamnocephalus platyurus-szal) szabványnak megfelelően végeztük.

A tesztszervezetek keltetését a teszt megkezdése előtt 24 órával kell megkezdeni. A petéket a keltetésre szolgáló Petri-csészébe visszük át 15 ml előlevegőztetett, 1:8 arányban hígított standard oldattal. A Petri-csészét lefedve 25°C-ra beállított inkubátorba helyezzük, melyben folyamatos, 3000-4000 lux fényerősségű megvilágítást biztosítunk.

Hígító és kontrol közegként az előlevegőztetett standard édesvizet használtuk. A kísérletek során három párhuzamos hígítási sort alkalmaztunk minden esetben. A megfelelő hígítási arányok beállítását követően 1-1 ml teszt oldatba 10-10 tesztállat került. A feltöltött mikropléteket 25°C-ra beállított inkubátorba helyeztük, az alkalmazott expozíciós idő 24 óra. 24 óra elteltével meghatároztuk a mortalitási arányt.

2.5. Mortalitás vizsgálatok Artemia salina héjnélküli kisrákon

A vizsgálatok elvégzéséhez szükséges tesztállatok petéit (JBL NovoTemia, Németország) helyi kisállat kereskedésből szereztük be és mesterségesen előállított standard sósvízben keltettük ki. A petéket 12 órán keresztül 4°C-on előhidratáltuk, majd az előhidratáció során alkalmazott standard oldatott lecseréltük. A petéket ez után folyamatos levegőztetés mellett 26°C-on inkubátorban 24 órán át keltettük.

A kísérletek során az Thamnocephalus platyurus tesztekhez hasonlóan 24 lyukú polisztirén mikropléteket alkalmaztunk. Hígító és kontrollközegként előlevegőztetett mesterséges sósvizet használtunk. A megfelelően higított mintákból 950μl-t adagoltunk a mikroplét celláiba, három párhuzamosban, majd ehhez 50μl (kb. 100-150 darab) lárvát

48 tartalmazó folyadékot pipettáztunk a keltető edényből. Az így feltöltött mikropléteket 24 órán át 26 °C fokon inkubáltuk, majd felülről, alsó megvilágítás mellett 10 másodperces felvételeket készítettünk a cellákról. Az így kapott felvételek alapján határoztuk meg később a mortalitás arányát.

CAMERA

MINTA

HIDEGFÉNY ADATRÖGZITŐ

ÁTALAKITÓ

5. ábra. Artemia salina akut toxicitási teszt során használt rendszer működési elve.

2.6. Vibrio fischeri biolumineszcencia-gátlás vizsgálat

A mérések kivitelezésére a Vibrio fischeri baktériumtörzset alkalmazó, Merck által gyártott ToxAlert 100 típusú luminométert használtuk. A teszt során alkalmazott baktérium törzs mélyhűtött állapotban egy évig is eltartható. A liofilizált baktérium, a tesztet megelőzően, egy standard oldatban került felolvasztásra, ezáltal aktiválódott. A faj sajátossága, hogy egészséges állapotban fényt bocsát ki (biolumineszcencia), amely fénykibocsátás csökken, ha a sejtek struktúrájában, vagy működésében változás következik be. A fénykibocsátás csökkenéséért a luciferáz nevű enzim inhibíciója tehető felelőssé.

A mérések során a kezeletlen baktérium szuszpenzió lumineszcenciáját hasonlítjuk össze a mintával kezelt szuszpenzió értékeivel 15, vagy 30 perces expozíciós idő letelte után. Így végeredményként százalékos értékben megkapjuk a minta hatására kiváltott gátlási arányt.

49 A ToxAlert 100 luminométer valamennyi értéket automatikusan kiszámít. Első lépésben az f_kt korrekciós faktor meghatározása történik, a mért lumineszcencia-intenzitási értékből ([1] egyenlet).

f_kt = l_kt / l₀ (t = 30 perc) [1]

ahol

fkt: az expozíciós (kontakt) időre megadott korrekciós faktor

lkt: lumineszcencia intenzitás a kontrollban, RLU-ban (relative luminescence units) mérve, az expozíciós idő után

l0: a kontroll tesztszuszpenzió lumineszcencia intenzitása közvetlenül a hígító (2%-os NaCl) oldat hozzáadása előtt.

A korrekciós faktor alkalmazásával az egyes tesztmintákra a készülék meghatározza l0

korrigált értékét ([2] egyenlet).

lct = l0 fkt [2]

ahol

f_kt: az f_kt értékek átlaga

l0: a kontroll szuszpenzió lumineszcencia intenzitása közvetlenül a hígító (2%-os NaCl) oldat hozzáadása előtt

l_ct: az l₀ korrigált értéke a küvettákra közvetlenül a tesztminta hozzáadása előtt.

Ezek után a tesztminta Ht inhibeáló effektusát számítja ki a készülék ([3] egyenlet).

H_t = [(l_ct - l_Tt/l_ct)] x 100 [3]

ahol

Ht: a tesztminta inhibeáló effektusa az expozíciós idő után, %-ban megadva

lct: az l0 korrigált értéke a tesztminta küvettákra közvetlenül a tesztminta hozzáadása előtt

lTt: a tesztminta lumineszcencia intenzitása az expozíciós idő után.

2.7. Enzimaktivitási vizsgálatok Artemia salina héjatlan kisrákon és Dikerogammarus villosus amphipoda rákon

Az enzimek aktivitását standard protokollok mikroplét adaptációi szerint határoztuk meg: a glutation-S transzferáz aktivitást (Habig et al. 1974), a tejsav dehidrogenáz

50 aktivitást (Vassault 1983)- és az acetilkolineszteráz aktivitást (Ellman et al. 1961). Az enzimatikus aktivitásokat összprotein tartalomra korrigáltuk (Bradford 1976).

2.7.1. LDH enzimaktivitási vizsgálatok

A mortalitási kísérletekben kezelt, még élő állatokat 1 ml Tris-NaCl (0,1 M; pH 7,2;

T=4°C) puffer oldatba helyeztük és -20°C-on fagyasztottuk. A minták felengedése után üvegpotterrel homogenizáltuk, ugyanabban a pufferben, amelyben előzőleg is tároltuk, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml Tris-NaCl pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk. Újrafagyasztás és kiolvasztás után 6000g mellett 3 percig 4°C-on centrifugáltuk a mintákat.

A mérés alapja az alábbi reakció:

piruvát + NADH+ H⁺ L − laktát + NAD⁺

Az enzimaktivitás meghatározásának alapja, hogy az enzim a piruvátot NADH jelenlétében tejsavvá alakítja. A reakció a NADH fogyásával követhető nyomon, a mért abszorbancia-változás alapján.

A mérések elvégzéséhez 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból 80-80 μl-t pipettáztunk a mikroplét celláiba, majd hozzáadtunk 140 μl NADH oldatot és 30 μl piruvát oldatot. Vak mintaként a következő oldatok elegyét használtuk: 100 μl Tris-NaCl, 80 μl NADH, 100 μl piruvát. A mikroplét olvasó készülék (Perkin Elmer Viktor³) segítségével mértük az abszorbancia változását, 340 nm-es hullámhosszon 20 másodpercenként, 5 percen keresztül (Diamantino et al. 2001; Vassault 1983).

Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható az LDH aktivitás a következő képlet által:

LDH = (ΔA/ min ×10⁶×TV)/ (6,3 ×10³×L×V), ahol:

ΔA/min –percenkénti abszorbancia változás;

TV- a teljes reakcióelegy térfogata ml-ben;

6,3 ×103 – a NADH moláris abszorpciója 340 nm-en;

LDH

51 L- a fény útja mm-ben (jelen esetben 0,7 mm);

V- a minta térfogata ml-ben.

2.7.2. GST enzimaktivitási vizsgálatok

A kezelt állatokat 0,5 ml APHA (pH 6,5; T=4°C) pufferbe helyeztük, majd -80°C-on tároltuk az enzimatikus vizsgálatig. A minták felengedése után ezeket üvegpotterrel homogenizáltuk, abban a pufferben, amelyben előzőleg tároltuk a naupliákat, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml friss APHA pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk. A mintákat 9000g mellett 4ºC-on 10 percig centrifugáltuk. A mérési módszer alapja a következő reakció:

A kolorimetriás meghatározás alapja a glutation s-transzferáz enzim által katalizált reakció glutation, valamint a szubsztrátként alkalmazott 1-klór-2,4-dinitrobenzol (CDNB) között. A megfelelő reakciókörnyezetben 6. ábra alapján lejátszódó reakció sebessége csak a jelenlévő aktív GST enzim mennyiségének a függvénye. A reakció terméke dinitrofenil-thioéter, melynek maximális abszorbanciája 340 nm-re esik (Frasco és Guilhermino 2002).

6. ábra. A GST enzim aktivitásának detektálásának alapjául szolgáló reakció A mérések kivitelezése során 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból 80-80 μl-t pipettáztunk a mikroplét celláiba majd hozzáadtunk 180 μl GSH-t (20 mM, 6,5 pH, PO4) és 20 μl CDNB-t (20 mM, 6,5 pH, PO4). Kontrollként a következő oldatok elegyét használtuk: 100 μl PBS, 190 μl GSH, 10 μl CDNB. Az abszorbanciaváltozást mikroplét olvasó készülékkel (Perkin Elmer Viktor³) mértük. A készülék a leolvasást 340 nm-es hullámhosszon, 5 percen keresztül, 20 másodperces olvasási gyakorisággal végezte.

Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható a GST aktivitás a következő képlet által:

52 ahol:

ΔA/min –percenkénti abszorbancia változás.

2.7.3. AChE enzimaktivitási vizsgálatok 2.7.3.1. In vivo AChE vizsgálatok

A kezelt rákokat 0,5 ml APHA (pH 6,5; T=4°C) pufferbe helyeztük, majd -20°C-on tároltuk az enzimatikus vizsgálatig. A minták felengedése után ezeket üvegpotterrel homogenizáltuk, abban a pufferben, amiben előzőleg tároltuk, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml friss APHA pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk.

A mérés elvi alapja az acetiltiokolin-jodid (ATCI) acetilkolinészteráz enzim katalizáló hatására létrejövő hidrolízis nyomon követése, mely közben tiokolin keletkezik. Ez a keletkező tiol folyamatos reakciója által lehetséges, a reakcióközegben jelenlévő 5,5-dinitro-bisz-2-nitrobenzol ionnal (I), melynek eredményeként 5-tio-2-nitrobenzolsav keletkezik (II). Ez utóbbi mennyisége a 412 nm-es hullámhosszon mérhető (Ellman et al. 1961).

AChEH2O + ATCI (CH3)3N⁺CH2 CH2S^- + CH3COO^- +2H⁺ (CH3)3N⁺CH2 CH2S^- + RSSR (CH3)3N⁺CH2 CH2SSR + RS^-

(I) (II)

A mérések elvégzésére 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból 50-50 μl-t pipettáztunk a mikroplétre majd hozzáadtunk 50 μl PBS (0,1 M) puffert, 100 μl DTNB oldatot (1mM) és 100 μl ATCI oldatot (1,5 mM). Kontrollként a következő oldatok elegyét használtuk: PBS, DTNB és ATCI.

Az abszorbanciaváltozást mikroplét olvasó készülékkel (Viktor³ Perkin Elmer) mértük.

A készülék minden a cellán mérte az abszorbanciát 412 nm-es hullámhosszon, folyamatosan, 10 percen keresztül.

AChE

53 Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható az AChE aktivitás a következő képlet által:

[μMol/perc/g]

ahol:

13600 = ATCI extinkciós koefficiens 0,7 = olvasási magasság a cellában (cm) Vs = bemért minta térfogata [50 μl]

V_cell = az assay térfogata [300 μl]

C0 = a feltárt szövetminta koncentrációja [mg/ml]

2.7.3.1. In vitro AChE vizsgálatok

A cianobaktériumok anatoxin-a(s) toxin termelő képességét Henriksen et al. (1997) alapján az in vitro acetilkolineszteráz enzim gátlás teszt alkalmazásával ellenőriztük. A módszert az anatoxin-a(s) specifikus toxikus hatása alapján dolgozták ki, amely a lebontó acetilkolineszteráz enzim aktivitásának irreverzibilis gátlásában nyilvánul meg.

A vizsgálathoz 25 mg alga liofilizátumot 1 ml 98%-os etanol és 1N ecetsav eleggyel (20:80) szobahőmérsékleten, 4 órán keresztül tártunk fel folyamatos keverés mellett. A nyers kivonatot centrifugáltuk (12 000 g, 10 perc, 4 °C), majd a tisztított frakción azonnal elvégeztük az in vitro acetilkolineszteráz gátlás tesztet. A tesztben 10 μl alga kivonatot 50 μl angolna acetilkolineszteráz (AChE) oldattal (5U ml-1, 0,1M KH₂PO₄, pH 8) szobahőmérsékleten inkubáltuk. Majd 3 ml KH₂PO₄ puffer (pH 8), 100 μl 0,1 mM ditiobisznitrobenzoát oldat (0,1 M foszfát pufferben, pH 7,2) és 20 μl 75 mM acetiltiokolin jodid hozzáadását követően az abszorpcióváltozást 412 nm-en 30 másodperces időintervallumonként 10 percig követtük nyomon. A minták enzimatikus gátlásának mértékét az algakivonat helyet foszfát pufferrel végzet enzimaktivitás teszt sebessége alapján becsültük. A tesztet mintánként 3 párhuzamban végeztük.

A detektálás alapját szolgáló reakció, valamint az eredmények érékelésének módja azonos az in vivo AChE enzimaktivitási vizsgálatok esetében bemutatottakkal.

54 2.7.4. Összprotein tartalom meghatározása

A kezelt rákokat kiolvasztás után 1 ml desztillált vízzel, majd 1 ml Tris-NaCl (0,1 M;

pH=7,2; T=4^oC) pufferrel mostuk, ezt követően a Tris-NaCl pufferben -20°C-on tároltuk. A minták felengedése után azokat 8000g mellett 4°C-on 8 percig centrifugáltuk.

A méréshez 96 lyukú mikroplétet használtunk, amelyben a fehérje mennyiséget Coomassie Brilliant Blue G-250 festék piros változatát alkalmazva határoztuk meg, mely fehérjéhez kötődve kék színt ad. A felülúszóból 10 μl-t pipettáztunk át 70 μl Tris-NaCl pufferbe, amihez 60 μl Bradford reagenst adtunk a fehérjetartalom meghatározásához. A Bradford reagens hozzáadása után a mintákat 10 percig sötétben, szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd mértük a minták abszorbanciáját a Victor³ plate olvasó készülékkel (Bradford 1976).

2.8. Analitikai módszerek

A szaxitoxinok csoportjába tartozó toxinok detektálására a Gerdts et al. (2002) által kidolgozott módszert alkalmaztuk. A cianobaktérium törzsek esetén 100 ml tenyészetet, míg a természetes fitoplankton minták esetén a minták töménységétől függően 0,5 – 1 l mintát (kb. 10⁵ sejt), centrifugálással koncentráltunk (3000 g, 10 perc), majd a pelletet ioncserélt vízzel átmostuk és újból centrifugálással koncentráltunk. Az algapelletet 1 – 2 ml 0,03 M ecetsavval szuszpenzióba vittük, majd jégfürdőben tartva 1 percig ultrahangos kezeléssel feltártuk (60 W). A nyers kivonatot centrifugálással tisztítottuk (12 000 g, 10 perc, 4^oC). Mintánként 100 μl nyers kivonathoz 400 μl perjódsav oldatot adtunk (50mM perjódsav, 4% v/v NH4OH), 50^oC fokon 15 percig inkubáltuk, majd 500 μl 1M ecetsav oldattal közömbösítettünk. Az oxidáció hatására a szaxitoxinok fluoreszcens vegyületi formákká alakulnak, majd a minták vizsgálata Shimadzu 4500 spektrofluoriméterrel a 333 nm-es excitációs hullámhosszon, és 390 nm-es emissziós hullámhosszon történt.

A cianobaktériumok vizes kivonatainak analitikai elemzése döntően az ismert cianotoxinok: a cilindrospermopszin, anatoxin-a, homoanatoxin-a és mikrocisztin-LR vizsgálatára irányultak. A cianotoxinok minőségi és mennyiségi meghatározását egy tömegspektrométerhez kötött folyadékkromatográffal végeztük. Az analitikai rendszer egy diódasoros detektorral felszerelt Agilent 1100 típusú folyadékkromatográf (Agilent,

55 Palo Alto, CA, USA) és egy Finnigan MAT LCQ klasszikus ioncsapdás tömegspektrométerből (ThermoElectron, San Jose, CA, USA) állt. A minták futtatásához egy Merck Purospher STAR C18e típusú kromatográfiás oszlopot alkalmaztunk (55mm x 4 mm I.D., 3 μm szemcseméret). A mintaelemzés 40 °C fokon, gradiens elúcióval történt (A oldat: 0,05% triflórecetsavas desztillált víz; B oldat: 0,05%

triflórecetsavas acetonitril; gradiens: 1-70% B, 20 perc időintervallumon), 1 ml min^-1 áramlási sebességen.

A diódasoros detektorral 200 – 800 nm hullámhossz tartományban szkenneltük a mintákat, a specifikus leolvasást 262-, 238- ill., 227 nm-en végeztük, melyek a cilindrospermopszin, mikrocisztin-LR, valamint anatoxinok fényelnyelési hullámhosszai. A cilindrospermopszin, mikrocisztin-LR és anatoxin-a azonosítása és mennyiségi meghatározása retenciós idő alapján, referencia toxinok alkalmazásával történt. A homoanatoxin-a azonosítását, referencia anyag hiányában (nincs kereskedelmi forgalomban), electronspray ionizáció útján történő molekula fragmentáció mintázat alapján végeztük (James et al. 2005). Mivel a homoanatoxin-a az anatoxin-a egyik izoformája, és a két vegyület azonos fényelnyelési tulajdonságokkal rendelkezik, a homoanatoxin-a mennyiségi meghatározását a referencia anatoxin-a kalibrációs görbéje alapján végeztük el (Furey et al. 2003).

A cianobaktérium minták hatóanyagainak tömegspektrometriai elemzése a Pannon Egyetem Környezettudományi Intézeti tanszék Levegőkémiai kutatócsoportjának laboratóriumában készült, Dr. Kiss Gyula szakmai irányításával.

2.9. Statisztikai elemzés

A nyers adatokat OriginLab OriginPro 8 és MS Excel 2007 program segítségével elemeztük és ábrázoltuk. Az enzimaktivitás kontrolhoz viszonyított változását lineáris regresszióval vizsgáltuk. A nyers adatokat a J.J. Hubert-féle probitszám analízissel hasonlítottuk össze (Hubert 1980). A kísérletek mindegyikét legalább háromszor megismételtük.

56

3. Eredmények és értékelés

3.1. Két új ökotoxikológiai módszer fejlesztése

Az új módszerek fejlesztése során elsődleges szempontunk volt olyan végpontok alkalmazása, melyek megfelelnek a mindennapi laboratóriumi tesztelés követelményeinek, lehetőség szerint kizárják az emberi szubjektivitásból adódó hibalehetőséget egyben gyorsítják a teszteljárás kivitelezését. Ezeknek a szempontoknak a két, alábbiakban bemutatott tesztmódszer maximálisan megfelel.

A teszteljárások kalibrálása során az ökotoxikológia területén elterjedten alkalmazott kalibráló/validáló szert, a kálium-bikromátot (K₂Cr₂O₇) használtunk. A választást az irodalomban fellelhető megfelelő mennyiségű adat és hatásmechanizmusuk megfelelő ismerete indokolta (Cope et al. 2004; Persoone et al. 2009). Az eredmények összehasonlíthatóságának érdekében a kiválasztott kalibráló szerre elvégeztük a tesztorganizmusokra meglévő konvencionális teszteket is. Így az általunk kidolgozott és a konvencionális eljárások által adott válaszok összehasonlíthatóvá váltak az irodalmi adatokkal.

3.1.1. Daphnia magna táplálkozás aktivitás teszt

A tesztmódszer alapját egy, a kereskedelmi forgalomban is kapható táplálkozás aktivitás-teszt, a Rapidtox (MicroBioTests, Belgium) képezi. Az említett eljárás a Thamnocephalus platyurus fajt használja tesztállatként, amely Amerikában őshonos édesvízi planktonrák, így ökológiai relevanciája hazai vizek tekintetében megkérdőjelezhető az őshonos Daphnia magna tesztszervezettel szemben. Ezen felül a Rapidtox eljárás nem pontosan meghatározott számú állat használatát írja elő, hanem meghatározott térfogatban (0,5 ml) lévő egyed tesztoldatba pipettázását írja elő. Így a bevitt állatok száma teljesen esetleges, ráadásul nem lehet szelektálni az élő (aktívan

A tesztmódszer alapját egy, a kereskedelmi forgalomban is kapható táplálkozás aktivitás-teszt, a Rapidtox (MicroBioTests, Belgium) képezi. Az említett eljárás a Thamnocephalus platyurus fajt használja tesztállatként, amely Amerikában őshonos édesvízi planktonrák, így ökológiai relevanciája hazai vizek tekintetében megkérdőjelezhető az őshonos Daphnia magna tesztszervezettel szemben. Ezen felül a Rapidtox eljárás nem pontosan meghatározott számú állat használatát írja elő, hanem meghatározott térfogatban (0,5 ml) lévő egyed tesztoldatba pipettázását írja elő. Így a bevitt állatok száma teljesen esetleges, ráadásul nem lehet szelektálni az élő (aktívan

In document Alternatív ökotoxikológiai tesztek környezetszennyező komponensek detektálására (Pldal 42-0)