Cianotoxinok

A cianotoxinok rendkívül változatos csoportja a természetes toxinoknak, mind kémiai, mind pedig toxikológiai szempontból. A cianobaktériumok sokféle különleges metabolitot termelnek, melyek funkciója nem teljesen tisztázott, bár némelyek (lehetséges, hogy csak indirekt módon), hatással vannak más biotópokra is (Wiegand és Pflugmacher 2005).

Tanulmányok sokasága született világszerte az 1980-as évek folyamán a cianobaktériumok előfordulási gyakoriságával és eloszlásával kapcsolatban, melyek során számos, egér-toxikológiai vizsgálat készült. Kvantitatív módszer a cianotoxinok meghatározására csak az 1980-as évek végétől áll rendelkezésre, azóta az egyes cianotoxinokkal kapcsolatos kutatások száma ugrásszerűen megnőtt. Ennek eredményeképp ma már ismert, hogy a neurotoxinok megjelenése kevésbé általános, mint az egyéb toxinok előfordulása. Ezzel szemben a ciklikus peptid toxinok (mikrocisztinek és nodularinok), melyek elsődlegesen májkárosodást okoznak, sokkal inkább elterjedtek és gyakori kísérői a cianobaktériumok által okozott algavirágzásoknak (Codd et al. 1999).

A cianobaktériumok által termelt toxikus anyagok okozta mérgezési tünetek mechanizmusa ma már jól ismert. Hatásuk nagyon sokrétű lehet, a hepatoxikus hatástól, neurotoxikus, dermatotoxikus hatáson át, egészen fehérjeszintézis általános gátlásáig terjed. A cianotoxinok három nagy kémiai csoportba sorolhatóak, ezek: ciklikus peptidek, alkaloidák, és lipopoliszacharidok (LPS). Vízi környezetben ezek a toxinok

35 általában a cianobaktériumok sejtjein belül maradnak és csak abban az esetben juthatnak a vízbe, ha valamilyen külső tényező jelentős sejtkárosodást okoz (Wiegand és Pflugmacher 2005; Araoz et al. 2009).

1.2.3.1. Hepatoxikus ciklikus peptidek – mikrocisztinek és nodularinok A cianobakteriális algavirágzásokat kísérő toxinok közül a ciklikus peptid típusú nodularin és mikrocisztin fordulnak elő leggyakrabban. Az ezeket termelő cianobaktériumok okozzák a legtöbb problémát a felszíni vízből történő ivóvíznyerés során. Egereken végzet toxikológiai kísérletek szerint, akut dózis esetén, mindössze néhány óra alatt halált okoznak, melynek elsődleges oka a fellépő májvérzés. A mikrocisztineket eddig planktonikus Anabaena, Microcystis, Oscillatoria (újabban Planktothrix), Nostoc, Anabaenopsis és a szárazföldi Hapalosiphon nemzetségekben mutatták ki (Carmichael 1992; Wiegand és Pflugmacher 2005). A mikrocisztinek több mint 80 variánsát írták le ez idáig, melyek LD50 értéke széles tartományban mozog (50 és 1200 μg kg^-1 egerekre, hasüregbe injekciózva) (Hotto et al. 2007). A nodularint viszont, eddig csak Nodularia spumigena fajjal kapcsolatban írták le (Carmichel et al.

1988).

A ciklikus peptidek viszonylag nagyméretű természetes anyagok, molekulatömegük (MW)≈800 Da és 1000 Da között van. Vagy öt (nodularinok, 1. ábra fent), vagy hét (mikrocisztinek, 1. ábra lent) aminosavból épülnek fel, melyek közül négy, illetve hat gyűrűt formál. Vízoldékonyak, és néhány kivételtől eltekintve, nem képesek áthatolni közvetlenül az állati és növényi sejtek lipid-membránján. Toxikus hatásukat ezért csak úgy fejthetik ki, ha membrán transzport folyamatok révén a sejtbe jutnak, amely egyébként csak bizonyos esszenciális biokémiai, vagy ásványi anyagokra jellemző.

Kémiai stabilitásuk és vízoldékonyságuk miatt a környezetben nagy perzisztenciával rendelkeznek, és a felszíni vizeken keresztül veszélyt jelentenek az emberre is.

36 A mikrocisztinek általános molekulaképlete a következő:

ciklo-(D-alanin-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-glutamát6-Mdha7); ahol X és Z különböző L aminosavakat jelölnek; a D-MeAsp D-eritro-β-metilaszparaginsav-nak felel meg, míg az Mdha N-metildehidroalanin-t jelent. Az Adda nevű aminosav, (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeka-4,6-diénsav, a legkülönlegesebb ezek között a vegyületek között. Ez utóbbi esszenciális a toxinok biológiai aktivitásához (Chorus és Bartram 1999).

1. ábra. A mikrocisztinek (lent) és a nodularinok általános felépítése (fent) (Codd et al. 1999)

Az első ilyen toxinokat a Microcystis aeruginosa fajból izolálták, innen ered a mikrocisztin név is. A mikrocisztinek közül talán leginkább ismert a mikrocisztin-LR (MC-LR). A MC-LR kovalensen kötődik a protein foszfatáz 1 (PP1) és a protein foszfatáz 2A-hoz (PP2A). Az MC-LR már 0.1 -1.0 nM koncentrációban direkt módon gátolja a PP2A működését azáltal, hogy irreverzibilisen kötődik az enzim karboxil végéhez, így a metiltranszferáz nem képes hozzáférni a foszfatázhoz. A mikrocisztin krónikus dózisa általános májkárosodást okoz, illetve arról is beszámoltak, hogy mikrocisztin tartalmú vizet fogyasztó embereknél megnőtt a májdaganat megjelenésének gyakorisága (Codd et al. 1999; MacKintosh et al. 1990).

37 A nodularin kémiai felépítse a következő: ciklo-(D-MeAsp-L-arginin-Adda-D-glutamát-Mdhb); ahol az Mdhb jelentése 2-(metilamino)-2-dehidrobutilén sav. A nodularinnak kevés, a természetben is előforduló variánsa ismert: kettő demetilált variáns; egy, melyben a D-MeAsp – t D-Asp helyettesíti, valamint egy, melyben az Adda helyett DMAdda található; illetve egy nem toxikus nodularin, melyben az Adda 6Z-szetereoizomerje foglal helyet. Az ezzel ekvivalens mikrocisztin Adda 6Z- izomerje ugyanígy nem toxikus (Namikoshi et al. 1994).

A mikrocisztin és a nodularin legtöbb változata erősen toxikus hatású és viszonylag szűk határon belül mozog toxicitásuk (egerek hasfalába injektált toxinokra 50-300 μg kg^-1 testsúly kilogrammonkénti LC50 értékek adódnak). Csak néhány nem mérgező variánsa ismert ezeknek a toxinoknak. Általánosságban elmondható, hogy minden olyan izomerizációs változás, amely az Adda-glutamát régiót érinti (például ha az Adda-dién 6E 6(Z)-vé izomerizálódik), vagy a glutamát acilizációja, megszűnteti a molekula toxikus hatását (Rinehart et al. 1994). A lineáris mikrocisztinek és nodularinok több mint százszor kevésbé mérgezőek, mint a hasonló ciklikus molekulák. A lineáris mikrocisztinek felfoghatóak úgy is, mint mikrocisztin-prekurzorok, és/vagy bakteriális bomlástermékek (Choi et al. 1993).

1.2.3.2. Neurotoxikus alkaloidák – anatoxinok és szaxitoxinok

A cianobakteriális nerotoxinok (a) a muszkuláris és idegi nikotin acetilkolin típusú receptorok antagonisztikus gátlása által (anatoxin-a, homoanatoxin-a), (b) az acetilkolinészteráz enzim irreverzibilis gátlása révén (anatoxin-a(S)), illetve (c) a Na⁺ -ion csatornák blokkolása által (szaxitoxinok) fejtik ki toxikus hatásukat. A cianobakteriális neurotoxinokat ez alapján három csoportra oszthatjuk; ez a csoportosítás jól tükrözi a toxinok kémiai szerkezetét is (Araoz et al. 2009):

 Anatoxin-a és homoanatoxin-a,

 Anatoxin-a(S),

 Szaxitoxinok.

Az alkaloid cianotoxinok kémiai stabilitása változó; mennek végbe rajtuk spontán folyamatok, melyek során még toxikusabb, vagy ártalmatlanabb melléktermékek keletkeznek. Néhányukon végbemehetnek fotokémiai reakciók is.

38 Az anatoxin-a jelenlétét Anabaena (Harada et al. 1989), Aphanizomenon (Selwood et al. 2007), Cylindrospermum (Sivonen et al. 1989), Microcystis (Park et al. 1993), Oscillatoria (Sivonen et al. 1989), Planktothrix (Viaggiu et al. 2004) és Raphidiopsis (Namikoshi et al. 2003) fajokból, míg homoanatoxin-a Oscillatoria (Skulberg et al.

1992), Anabaena (Furey et al. 2003), Raphidiopsis (Namikoshi et al. 2003) és Phormidium (Wood et al. 2007) fajokból került kimutatásra. Számos faj képes ugyanakkor a két toxin szimultán szintézisére, ilyen a Raphidiopsis mediterranea Skuja (Namikoshi et al. 2003), és néhány Oscillatoria faj (Araoz et al. 2005).

Az anatoxin-a egy kis molekulatömegű alkaloida (MW=165 Da), szekunder amin, 2-acetil-9-azabiciklo(4-2-1)non-2-én (2. ábra, balra). A homoanatoxin-a (MW=179 Da) az anatoxin-a homológja, (2. ábra középen). A 2-es szénatomon egy propionil csoport foglal helyet, az anatoxin acetil csoportja helyén. A két vegyület LD50 értéke egerekre 250 μg kg^-1 körül adódik (Devlin et al. 1977; Araoz et al. 2009).

2. ábra. Anatoxinok általános felépítése. Anatoxin-a balra, homoanatoxin-a középen, anatoxin-a(S) jobbra (Codd et al. 1999)

Toxikus hatásukat állatok (emlősok és madarak) esetében azáltal fejtik ki, hogy az acetilkolint imitálva irreverzibilisen kötődnek a nikotin acetilkolin típusú receptorokhoz. Ezáltal a nátriumcsatornákat nyitva tartják és az így beáramló nátrium-ionok túlstimulálják a sejtet. Növények esetében a fotoszintetikus oxigéntermelés csökkenéséről, glutation S-transzferáz enzim és peroxidáz szint megemelkedéséről számolnak be (Mitrovic et al. 2004).

Az anatoxin-a(S) a ciklikus n-hidroxiguanin egyszeres foszfát észtere, amelyet egy Anabaena flos-aquae (Mahmood és Carmichael 1986) törzsnél mutattak ki elsőként (2.

ábra, jobbra). Molekulatömege MW=253 Da. A közelmúltban azonosították és izolálták Anabaena lemmermannii (Henriksen et al. 1997) által okozott algavirágzások vizsgálata során. Egereken végzett toxikológiai vizsgálatok alapján az anatoxin-a(S)

39 LD50-értéke 20 μg kg^-1 (Onodera et al. 1997). Az anatoxin-a(S) egyéb szerkezeti variánsai nem ismertek. Hatása hasonló a szerves foszfát- és karbamát típusú inszekticidekéhez, mint például, a paraoxon; irreverzibilisen kötődik az acetilkolénészteráz enzimhez (Araoz et al. 2009).

A szaxitoxinokat elsőként az alaszkai vajkagylóból (Saxidomus giganteus) izolálták, amelyben egy vörös színű algából akkumulálódott (Schantz et al. 1957). Szaxitoxinokat néhány cinaobaktérium (Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Lyngbya, Planktothrix) faj esetében találtak (Negri és Jones 1995).

3. ábra. Szaxitoxinok általános felépítése (Codd et al. 1999)

Közel harminc stabil szaxitoxin variánst különítettek el, amelyek közül néhány valószínűleg kémiai bomlástermék bizonyos fajokban. A szaxitoxinok a karbamált alkaloid toxinok egy csoportja, melyen belül lehetnek kénmentesek (szaxitoxin – STX), egyszeresen szulfatáltak (gonyautoxinok – GTX), vagy kétszeresen szulfatáltak (C – toxinok) (3. ábra). Néhány fajban azonosítottak még dekarbamált variánsokat és néhány új toxint is (Araoz et al. 2009).

Hatását az által fejti ki, hogy blokkolja az idegsejtek nátrium-csatornáit, ezáltal lehetetlenné válik a nátrium-ion beáramlás a sejtbe, ami paralízishez vezet (Cestele és Catterall 2000; Bricelj et al. 2005).

1.2.3.3. Citotoxikus alkaloidák

A clindrospermopszin egy ciklikus guanidin alkaloida Mw=415 Da-os molekulatömeggel (4. ábra), melyet néhány édesvízi cianobaktérium, például a Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans és az Aphanizomenon ovalisporum

40 termel. Vegytiszta formában a cilindrospermopszin a májat támadja, de a C. raciborskii törzsből készült nyers kivonatot egerekbe injektálva, más szerveken is patológiai tüneteket okozott (vesében, lépben, thymusban és a szívben). A tiszta cilindrospermopszin LD₅₀ értéke egerek hasfalába injektálva 2.1 mg/kg 24 óra alatt (Ohtani et al. 1992). A cilindrospermopszin gátlólag hat a proteinfoszfatáz enzimekre és szignifikánsan gátolja a proteinszintézist. Hatására glutation S-transzferáz aktivitásváltozást is kimutattak (Metcalf et al. 2002) (Lindsay et al. 2006).

4. ábra. Cilindrospermopszin általános felépítése (Codd et al. 1999) 1.2.3.4. Iritatív toxinok – lipopoliszaharidok

A lipopoliszacharidok (LPS) a Gram-negatív baktériumok sajátjai. A lipopoliszacharidok kondenzált cukor származékok, általában egy hexózból és valamilyen lipidből állnak, leggyakrabban egy hidroxi C14-C18 zsírsavból. Szerkezeti szempontból, az LPS egy polimer komplex, amely négy régióból áll. Az I. régió az O-antigén régió, amelyben oligoszacharid egységek ismétlődnek. Ezek szerkezete különböző, számos eltérő cukorgyök és glikogén egység összekapcsolódása révén jönnek létre. Ahogy a név is sugallja, az O-antigének tartalmaznak néhány olyan antigén determinánst, amely számos lizogén bakteriofág receptor helyein is megtalálható. A II. és a III. régiók a poliszacharid külső vázát és belső gerincét adja. A molekulák vázát alkotó vegyületek rendszerint csak kis változatosságot mutatnak különböző fajok esetében. A molekula gerincét alkotó régió egy glikolipidhez csatlakozik (A-lipid; IV. régió), egy rövid kapcson, 3-deoxi-D-mannózsavon (KDO) keresztül. Az A-lipid egy diszacharid, amelyben a glükózamint foszfát, zsírsav, vagy KDO helyettesíti, bár a cianobaktériumok esetében ez utóbbi aránya alacsony, vagy hiányzik. Az A-lipid komponenshez acetil csoporton keresztül kapcsolódik egy észterezett, vagy amid típusú hidroxi-zsírsav is.

41 Ezek az anyagok pirogénak és toxikusak. Többnyire a zsírsav komponens az, amely iritatívan, allergénként hat az emberre és az emlősökre. A cianobakteriális LPS azonban határozottan gyengébb hatású, mint az egyéb, patogén Gramm-negatív enterobaktériumok lipopoliszacharidjai, mint például a szalmonelláé. Az LPS-ek számos enzimre hatással lehetnek, így például csökkentik a GST-aktivitást, valamint a P450 izoenzim (CYP 1A2, Cyp 2B1/2) aktivitást (Wiegand és Pflugmacher 2005).

42