Enzimaktivitási vizsgálatok Artemia salina héjatlan kisrákon és Dikerogammarus

Az enzimek aktivitását standard protokollok mikroplét adaptációi szerint határoztuk meg: a glutation-S transzferáz aktivitást (Habig et al. 1974), a tejsav dehidrogenáz

50 aktivitást (Vassault 1983)- és az acetilkolineszteráz aktivitást (Ellman et al. 1961). Az enzimatikus aktivitásokat összprotein tartalomra korrigáltuk (Bradford 1976).

2.7.1. LDH enzimaktivitási vizsgálatok

A mortalitási kísérletekben kezelt, még élő állatokat 1 ml Tris-NaCl (0,1 M; pH 7,2;

T=4°C) puffer oldatba helyeztük és -20°C-on fagyasztottuk. A minták felengedése után üvegpotterrel homogenizáltuk, ugyanabban a pufferben, amelyben előzőleg is tároltuk, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml Tris-NaCl pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk. Újrafagyasztás és kiolvasztás után 6000g mellett 3 percig 4°C-on centrifugáltuk a mintákat.

A mérés alapja az alábbi reakció:

piruvát + NADH+ H⁺ L − laktát + NAD⁺

Az enzimaktivitás meghatározásának alapja, hogy az enzim a piruvátot NADH jelenlétében tejsavvá alakítja. A reakció a NADH fogyásával követhető nyomon, a mért abszorbancia-változás alapján.

A mérések elvégzéséhez 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból 80-80 μl-t pipettáztunk a mikroplét celláiba, majd hozzáadtunk 140 μl NADH oldatot és 30 μl piruvát oldatot. Vak mintaként a következő oldatok elegyét használtuk: 100 μl Tris-NaCl, 80 μl NADH, 100 μl piruvát. A mikroplét olvasó készülék (Perkin Elmer Viktor³) segítségével mértük az abszorbancia változását, 340 nm-es hullámhosszon 20 másodpercenként, 5 percen keresztül (Diamantino et al. 2001; Vassault 1983).

Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható az LDH aktivitás a következő képlet által:

LDH = (ΔA/ min ×10⁶×TV)/ (6,3 ×10³×L×V), ahol:

ΔA/min –percenkénti abszorbancia változás;

TV- a teljes reakcióelegy térfogata ml-ben;

6,3 ×103 – a NADH moláris abszorpciója 340 nm-en;

LDH

51 L- a fény útja mm-ben (jelen esetben 0,7 mm);

V- a minta térfogata ml-ben.

2.7.2. GST enzimaktivitási vizsgálatok

A kezelt állatokat 0,5 ml APHA (pH 6,5; T=4°C) pufferbe helyeztük, majd -80°C-on tároltuk az enzimatikus vizsgálatig. A minták felengedése után ezeket üvegpotterrel homogenizáltuk, abban a pufferben, amelyben előzőleg tároltuk a naupliákat, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml friss APHA pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk. A mintákat 9000g mellett 4ºC-on 10 percig centrifugáltuk. A mérési módszer alapja a következő reakció:

A kolorimetriás meghatározás alapja a glutation s-transzferáz enzim által katalizált reakció glutation, valamint a szubsztrátként alkalmazott 1-klór-2,4-dinitrobenzol (CDNB) között. A megfelelő reakciókörnyezetben 6. ábra alapján lejátszódó reakció sebessége csak a jelenlévő aktív GST enzim mennyiségének a függvénye. A reakció terméke dinitrofenil-thioéter, melynek maximális abszorbanciája 340 nm-re esik (Frasco és Guilhermino 2002).

6. ábra. A GST enzim aktivitásának detektálásának alapjául szolgáló reakció A mérések kivitelezése során 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból 80-80 μl-t pipettáztunk a mikroplét celláiba majd hozzáadtunk 180 μl GSH-t (20 mM, 6,5 pH, PO4) és 20 μl CDNB-t (20 mM, 6,5 pH, PO4). Kontrollként a következő oldatok elegyét használtuk: 100 μl PBS, 190 μl GSH, 10 μl CDNB. Az abszorbanciaváltozást mikroplét olvasó készülékkel (Perkin Elmer Viktor³) mértük. A készülék a leolvasást 340 nm-es hullámhosszon, 5 percen keresztül, 20 másodperces olvasási gyakorisággal végezte.

Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható a GST aktivitás a következő képlet által:

52 ahol:

ΔA/min –percenkénti abszorbancia változás.

2.7.3. AChE enzimaktivitási vizsgálatok 2.7.3.1. In vivo AChE vizsgálatok

A kezelt rákokat 0,5 ml APHA (pH 6,5; T=4°C) pufferbe helyeztük, majd -20°C-on tároltuk az enzimatikus vizsgálatig. A minták felengedése után ezeket üvegpotterrel homogenizáltuk, abban a pufferben, amiben előzőleg tároltuk, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml friss APHA pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk.

A mérés elvi alapja az acetiltiokolin-jodid (ATCI) acetilkolinészteráz enzim katalizáló hatására létrejövő hidrolízis nyomon követése, mely közben tiokolin keletkezik. Ez a keletkező tiol folyamatos reakciója által lehetséges, a reakcióközegben jelenlévő 5,5-dinitro-bisz-2-nitrobenzol ionnal (I), melynek eredményeként 5-tio-2-nitrobenzolsav keletkezik (II). Ez utóbbi mennyisége a 412 nm-es hullámhosszon mérhető (Ellman et al. 1961).

AChEH2O + ATCI (CH3)3N⁺CH2 CH2S^- + CH3COO^- +2H⁺ (CH3)3N⁺CH2 CH2S^- + RSSR (CH3)3N⁺CH2 CH2SSR + RS^-

(I) (II)

A mérések elvégzésére 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból 50-50 μl-t pipettáztunk a mikroplétre majd hozzáadtunk 50 μl PBS (0,1 M) puffert, 100 μl DTNB oldatot (1mM) és 100 μl ATCI oldatot (1,5 mM). Kontrollként a következő oldatok elegyét használtuk: PBS, DTNB és ATCI.

Az abszorbanciaváltozást mikroplét olvasó készülékkel (Viktor³ Perkin Elmer) mértük.

A készülék minden a cellán mérte az abszorbanciát 412 nm-es hullámhosszon, folyamatosan, 10 percen keresztül.

AChE

53 Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható az AChE aktivitás a következő képlet által:

[μMol/perc/g]

ahol:

13600 = ATCI extinkciós koefficiens 0,7 = olvasási magasság a cellában (cm) Vs = bemért minta térfogata [50 μl]

V_cell = az assay térfogata [300 μl]

C0 = a feltárt szövetminta koncentrációja [mg/ml]

2.7.3.1. In vitro AChE vizsgálatok

A cianobaktériumok anatoxin-a(s) toxin termelő képességét Henriksen et al. (1997) alapján az in vitro acetilkolineszteráz enzim gátlás teszt alkalmazásával ellenőriztük. A módszert az anatoxin-a(s) specifikus toxikus hatása alapján dolgozták ki, amely a lebontó acetilkolineszteráz enzim aktivitásának irreverzibilis gátlásában nyilvánul meg.

A vizsgálathoz 25 mg alga liofilizátumot 1 ml 98%-os etanol és 1N ecetsav eleggyel (20:80) szobahőmérsékleten, 4 órán keresztül tártunk fel folyamatos keverés mellett. A nyers kivonatot centrifugáltuk (12 000 g, 10 perc, 4 °C), majd a tisztított frakción azonnal elvégeztük az in vitro acetilkolineszteráz gátlás tesztet. A tesztben 10 μl alga kivonatot 50 μl angolna acetilkolineszteráz (AChE) oldattal (5U ml-1, 0,1M KH₂PO₄, pH 8) szobahőmérsékleten inkubáltuk. Majd 3 ml KH₂PO₄ puffer (pH 8), 100 μl 0,1 mM ditiobisznitrobenzoát oldat (0,1 M foszfát pufferben, pH 7,2) és 20 μl 75 mM acetiltiokolin jodid hozzáadását követően az abszorpcióváltozást 412 nm-en 30 másodperces időintervallumonként 10 percig követtük nyomon. A minták enzimatikus gátlásának mértékét az algakivonat helyet foszfát pufferrel végzet enzimaktivitás teszt sebessége alapján becsültük. A tesztet mintánként 3 párhuzamban végeztük.

A detektálás alapját szolgáló reakció, valamint az eredmények érékelésének módja azonos az in vivo AChE enzimaktivitási vizsgálatok esetében bemutatottakkal.

54 2.7.4. Összprotein tartalom meghatározása

A kezelt rákokat kiolvasztás után 1 ml desztillált vízzel, majd 1 ml Tris-NaCl (0,1 M;

pH=7,2; T=4^oC) pufferrel mostuk, ezt követően a Tris-NaCl pufferben -20°C-on tároltuk. A minták felengedése után azokat 8000g mellett 4°C-on 8 percig centrifugáltuk.

A méréshez 96 lyukú mikroplétet használtunk, amelyben a fehérje mennyiséget Coomassie Brilliant Blue G-250 festék piros változatát alkalmazva határoztuk meg, mely fehérjéhez kötődve kék színt ad. A felülúszóból 10 μl-t pipettáztunk át 70 μl Tris-NaCl pufferbe, amihez 60 μl Bradford reagenst adtunk a fehérjetartalom meghatározásához. A Bradford reagens hozzáadása után a mintákat 10 percig sötétben, szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd mértük a minták abszorbanciáját a Victor³ plate olvasó készülékkel (Bradford 1976).