3. Eredmények és értékelés
3.5. A cianobaktériumok nyers kivonatainak analitikai elemzése
cilindrospermopszin, anatoxin-a, homoanatoxin-a, honoanatoxin-a(s), valamint szaxitoxinok azonosítását és mennyiségi meghatározását végeztük el. Az AQS és PCC 6506 törzsek vizes kivonataiban a cilindrospermopszin és anatoxin-a azonosítása UV detektálást alkalmazva a retenciós idő-, valamint molekulatömeg alapján történt. Az ismert cianotoxinok azonosítása és mennyiségi meghatározása részben standard (kereskedelemben kapható) toxinok alkalmazásával, illetve a tömegspektrumok irodalmi adatokkal való összehasonlítása alapján történt. A szaxitoxinok detektálása spektrofotometriás úton történt.
A cinaobakteriális vizes kivonatok elemzése során 50 különböző molekulát sikerült elkülönítenünk a kromatogramok és a tömegspektrumok elemzése során 8. táblázat).
Az 50 molekulából mindösszesen négyet tudtunk minden kétséget kizáróan azonosítani
77 (anatoxin-a, homoanatoxin-a, cilindrospermopszin, valamint fenil-alain) részben irodalmi adatok, részben referencia minták által. A C. raciborskii törzsekre (AQS, ACT ACT 9502, ACT 9503, ACT 9504, ACT 9505) 6 molekula bizonyult specifikusnak (Rt=0,7’ m/z=244,1; Rt=1,0’ m/z=330,1; Rt=1,9’ m/z=152,1 ; Rt=2,5’ m/z=276,1;
Rt=2,8’ m/z=479,2; Rt=11,9’ m/z=228,3). Ugyanakkor 13 molekula csak a balatoni törzsekben volt megtalálható.
8. táblázat. Az azonosított molekulák megoszlása az egyes algatörzsek esetében Összes Azonosított
Összes molekula 50 4
C. raciborskii fajra specifikus 6 0
Balatoni C. raciborskii fajra specifikus 13 0
AQS specifikus 12 1
PCC 9606 specifikus 11 2
Mindegyikben megtalálható 2 1
Az elkülönített molekulák közül 41 bizonyult UV-aktívnak. Ezek közül hét csak az AQS törzsre volt jellemző (Rt=0,6’ m/z=209,1 Rt=0,8’ m/z=209,1 Rt=1,6’ m/z=269,1 Rt=1,8’ m/z=416,2 Rt=2,1’ m/z=240,1 Rt=2,8’ m/z=238,1 Rt=15,6’ m/z=270,4). A felsorolt ionok közül egyet tudtunk azonosítani, az 1,8 perces retenciós idővel eluálódó cilindrospermopszint (16. ábra).
16. ábra. Az AQS C. raciborskii törzs teljes ion (fent) és UV kromatogramja (lent).
Kékkel a törzsre kizárólagosan jellemző UV-aktív ionok; pirossal kiemelve a cilindrospermopszin.
78 Az UV-aktív ionok közül nyolc kizárólag a PCC 6506 törzsben volt megtalálható (Rt=0,5 m/z=191,0; Rt=1,7’ m/z=416,2; Rt=1,9’ m/z=230,2; Rt=2,7’ m/z=479,2; Rt=3,0’
m/z=166,1; Rt=4,2’ m/z=180,1; Rt=11,3’ m/z=303,2; Rt=13,3’ m/z=331,3). Ezek közül kettő volt azonosítható, a 3,1 perces retenciós idővel megjelenő anatoxin-a, illetve a 4,0 percnél eluálódó homoanatoxin-a (17. ábra).
17. ábra. A PCC 6506 törzs teljes ion (fent) és UV kromatogramja (lent). Kékkel a törzsre kizárólagosan jellemző UV-aktív ionok; pirossal kiemelve az anatoxinok.
A 41 UV-tartományban aktív molekula közül nyolc (Rt=0,5 m/z=293,1; Rt=0,8 m/z=244,1; Rt=0,9 m/z=137,1; Rt=1,3 m/z=240,1; Rt=1,4 m/z=240,1; Rt=2 m/z=152,1;
Rt=2,2 m/z=406,3; Rt=2,8 m/z=204,1; Rt=14,2 m/z=291,3) található meg kizárólag a balatoni C. raciborskii törzsekben (18. ábra).
79 18. ábra. Az balatoni ACT 9504 C. raciborskii törzs teljes ion (fent) és UV kromatogramja (lent). Kékkel a törzsre kizárólagosan jellemző UV-aktív ionok; pirossal kiemelve a fenil-alanin.
Az alkalmazott kromatográfiás protokoll alapján a tisztított cilindrospermopszin (CYN) 1,8 perces retenciós időnél eluálódott (19. ábra A) az oszlopról, és a tömegspektrométer pozitív ionizációs üzemmódja miatt a tömegspektrumokon a m/z=416,1 molekulatömeg (M+) alapján detektáltuk (19. ábra A, jobbra). A fényelnyelési maximumot =262 nm UV hullámhosszon szkenneltük. Az anatoxin-a referencia (Atx) azonos kromatográfiás körülmények között 2,9 perces retenciós időnél eluálódot, az M+ = 166,1 molekulatömeggel, =227 nm UV szkennelési hullámhosszon (19. ábra és ábra).
Cilindrospermopszin egyedül az AQS tisztított frakciójában volt kimutatható (19. ábra B). A CYN referenciával azonos retenciós időnél eluálódott az oszlopról (1,8’), azonos tömeggel (416,1 Da). A mért paraméterek teljes azonosságot mutattak a CYN referenciával, ezért a hatóanyag azonosítása minden kétséget kizáró. A CYN referencia kalibrációs görbéje alapján az AQS cianobaktérium liofilizátumának CYN tartalma 12,7 mg CYN g-1 alga liofilizátum.
80 nyers kivonata, (C) ACT 9502, (D) ACT 9504. A kisebb kromatogramok az (A) és (B) esetben a : m/z = 416 tömegű molekula ionkromatogramja.
Látható, hogy a tisztított toxin és az AQS esetében CYN azonosított összetevő retenciós ideje (Rt) 1,8 perc. Ugyanakkor az összesített CYN azonos retenciós időknél az ACT esetében megjelent ion tömege m/z = 268 (C ill. D), illetve a kisebb ábrákon a m/z = 416 tömegű molekula ionkromatogramja látható, azonban retenciós ideje jelentősen különböző (Rt =1,31 perc), amely a CYN hiányát mutatja az ACT 9502, és ACT 9504 törzsek esetében.
A balatoni törzsek esetében azonos retenciós idő mellett (Rt=1,8’) eluálódott ion esetében a specifikus ionkromatogram m/z=of 268.1 Da tömegű molekula jelenlétét mutatta (19. ábra C és D). Ugyanakkor megtalálható volt a CYN-hez hasonló tömegű molekula, melynek retenciós ideje jelentősen különböző a CYN-től (19. ábra C és D) (Rt =1,31’).
A PCC 6506-os törzs alga liofilizátumának LC-MS elemzése során a mintákban az Atx és Hman toxinok előfordulását vizsgáltuk, ugyanis a törzset a Pasteur Intézet Algabankjából szereztük azzal a céllal, hogy vizsgálatainkban neurotoxinokat termelő pozitív referencia mintaként alkalmazzuk. A törzs, mint Atx és Hman toxintermelő törzs van nyilvántartásban. Az Atx azonosítását és mennyiségi meghatározását, toxin referencia alkalmazásával végeztük, míg a Hman azonosítása az irodalomban közölt
81 kromatográfiás paraméterek, valamint a Furey et al. (2003) által leírt fragmentációs mintázat alapján történt.
20. ábra. A PCC 6506 cianobaktérium LC-MS kromatogramja: A – összion kromatogram; B – az Atx M+ = 166 Da tömegű molekula kromatogramja;
C – a Hman M+ = 188 Da tömegű molekula kromatogramja; D – a minta UV kromatogramja 227 nm-en.
A PCC 6506 minta elemzése során az Atx, a referenciatoxinnak megfelelő retenciós időnél eluálódott (3 perc) és a pozitív töltésű molekulatömege is azonos volt (20. ábra).
Ennek alapján, a minta Atx tartalmát 124 μg g-1 alga liofilizátum koncentrációban határoztuk meg.
A minta Atx tartalma viszonylag alacsony toxintermelő képességet jelent, ellenben egy számottevően nagyobb mennyiségben jelenlévő komponenst is találtunk, amely 4,2 perces retenciós időnél eluálódott az oszlopról és a pozitív töltésű molekulatömege M+ 188 Da-nak adódott. Irodalmi adatok alapján arra következtettünk (Furey et al. 2003;
James et al. 2005), hogy ez a vegyület a Hman toxin lehet. A feltevés igazolására elvégeztük a molekula ESI-MS/MS fragmentációját és összevetettük a kapott fragmentumok tömegének és arányának mértékét az irodalomban Hman toxinra leírt adatokkal (21. és 22. ábra).
3’
82 21. ábra. Az anatoxin-a és homoanatoxin-a MSn fragmentációjának lehetséges
módozatai.
A Hman MS/MS fragmentációja során az első hasítási lépcsőben legnagyobb tömegarányban egy M+ 163 Da tömegű molekula jelenik meg, ami a kezdeti molekulából az ammónia leválásából képződik. A második hasítást követően a jellemző fragmentum M+ =145 Da tömeggel rendelkezik, ami egy szénmonoxid leválásából következik.
A PCC 6506 minta tisztított frakciójában valószínűsített Hman molekula ESI-MS/MS fragmentációja során az irodalmi adatokkal teljes mértékben egyező hasítási mintázatott kaptunk, ami igazolta, hogy az általunk izolált molekula a homoanatoxin-a cianotoxin.
22. ábra. A PCC 6506 mintában talált M+ 180 Da molekula ESI-MS/MS tömegspektruma
Miután teljes mértékben bizonyossá vált, hogy a PCC 6506 mintában a Hman toxint detektáltuk, az Atx referencia fényelnyelési paraméterei alapján elvégeztük a mennyiségi meghatározást, ami 3200 μg Hman g-1 alga liofilizátumnak adódott.
Eredményeink nagy egyezést mutattak a törzzsel irodalomban leírt adatokkal (Araoz et al. 2008).
83 A balatoni C. raciborskii minták tisztított frakcióinak elemzése során, az elvárásoknak megfelelően, a CYN egyetlen mintában sem fordult elő. Az anatoxinok esetén azonban mind a négy törzsben kisebb relatív intenzitással megtalálhatóak voltak olyan csúcsok, melyek anatoxin-a jelenlétére utaltak. Az anatoxin-a referenciához közeli retenciós idővel (2,9 perc), kis intenzitással eluálódott anyag molekulatömege az anatoxin-a-val azonos, 166 Da molekula tömeggel rendelkezett. A molekula ESI-MS/MS fragmentációs képe azonban nem támasztotta alá feltevésünket, miszerint ez anatoxin-a lenne az ismeretlen anyag. Az azonosítatlan molekula a fragmentációs vizsgálat alapján fenil-alaninként azonosítottuk, mely az anatoxin-a-hoz közeli retenciós idővel, UV-abszorbanciával és azonos molekulatömeggel rendelkező pszeudo-molekuláris iont képez adott körülmények között (Furey et al. 2005) (23. ábra).
23. ábra. Az ACT 9502 cianobaktérium LC-MS kromatogramja: felül – összion kromatogram; középen – a talált ismeretlen M+ = 166 Da tömegű molekula kromatogramja; alul – az ismeretlen molekula MS/MS spektruma.
A cianobaktérium minták analitikai elemzése az AQS törzs cilindrospermopszin termelését mutatta ki nagy mennyiségben. A PCC 6506 mintánál mindkét anatoxin homológ termelése igazolódott, az irodalomban leírt mennyiségi különbségekkel egyezően (Araoz et al. 2008). Az enzimatikus vizsgálatok által mutatott kolinerészteráz-gátlás ellenére anatoxin-a(S) jelenlétét egyetlen mintában sem észleltük. Szaxitoxinok jelenlétére az elvégzett spektrofotometriás mérések nem utaltak.
84 Az alkalmazott analitikai módszerek az ismeretlen komponensek molekuláris és strukturális azonosítására nem alkalmasak.
85