Két új alternatív tesztrendszer: a Daphnia magna táplálkozás aktivitás-gátlás és Duckweed Detector (DwD) – szoftveres képelemzési módszer Lemna minor növekedés-gátlás elemzésére; kidolgozása és kalibrálása történt meg. Az eljárások kalibrálásuk során kálium-dikromátra megfelelő érzékenységet és kisebb szórást mutattak a konvencionálisan alkalmazott rendszerekhez képest mindkét esetben. E mellett az új eljárások kiküszöbölik az emberi szubjektivitásból adódó hibalehetőségek jelentős részét. A Daphnia magna táplálkozás aktivitás teszt megfelelő érzékenységet mutatott cianobakteriális toxicitás értékelése során is.
A korábbi évek során a Balatonból izolált Cylindrospermopsis raciborskii törzsek általános toxicitásának összehasonlító vizsgálata kismértékű különbségeket mutatott a törzsek között. Az öt bioassay vizsgálatban (Daphtoxkit F, Daphnia magna táplálkozás-aktivitás teszt, ToxAlert 100, Thamnotox-F, ArTox), a balatoni C. raciborskii izolátumok toxicitása nagyságrenddel kisebb, mint a pozitív referenciaként alkalmazott AQS ausztrál C. raciborskii faj hatása. Az ACT 9504, illetve, ACT 9502 balatoni cianobaktériumok toxicitása az anatoxinokat termelő PCC 6506 törzs hatásával mérhető össze.
A cianobakteriális tömegprodukció környezeti kockázatának becslésére a legelőnyösebbnek a Vibrio fisheri és Daphnia magna táplálkozás-aktivitás teszt bizonyult, mivel a teszt időtartama előkészítéssel együtt kevesebb, mint 2 illetve 5 óra.
A legérzékenyebb eljárás a Thamnocephalus platyurus teszt, mivel a rák naupliák már a μg/ml expozíciós szinten é2zékenyen reagáltak a cianobaktérium kivonatok bioaktív hatásaira. Utóbbi teszt alapján még a balatoni törzsek toxicitása között is a különbségek lényegesen erőteljesebben voltak kimutathatók. Az Artemia salina és a Daphnia magna immobilitás teszt érzékenysége a Vibrio fisheri módszerével közel azonos, az elemzés lényegesen hosszabb időtartama miatt azonban, ha csak az általános toxikus hatásbecslés a cél, ez az eljárás kevésbé előnyös. Ugyanakkor a Daphnia magna táplálkozás-aktivitás teszt (2 órás expozíciót alkalmazva) közel egy nagyságrenddel bizonyult érzékenyebbnek az utóbb említett módszereknél. Érzékenysége ugyan elmarad a Thamnocephalus platyurus teszttől, ám kivitelezhetőségének gyorsaságát is figyelembe véve, a legjobban használható módszerek egyike. A sórák naupliák bevonása bioassay vizsgálatokba azonban egy nagyon fontos előnyt is jelent, ugyanis a
86 vizsgálat minimális térfogatban végezhető el, 1 ml térfogatban akár 100 egyed is kezelhető, továbbá a letalitási tesztet túlélő egyedek közvetlen biokémiai marker vizsgálatokba is bevonhatók.
A sórák tesztekben életben maradt naupliák egésztest-homogenizátumának enzimvizsgálata során az AQS törzs jelentős LDH aktivitás növekedést, ill. GST aktivitás gátlást váltott ki a tesztállatokban, ami a cilindrospermopszin sajátos citotoxikus ill., hepatotoxikus jellegéből adódik. Az AQS törzs kivonatával ellentétben minden balatoni Cylindrospermopsis raciborskii ill., a PCC 6506-os törzs nyers kivonata szignifikáns GST aktivitásnövekedést okozott a sórák lárvákban, mely dózisfüggően nőtt az IC50 expozíciós küszöbig. A PCC 6505, valamint ACT 9504 és ACT 9502 törzsek szignifikáns AChE aktivitás gátlást okoztak, ami a cianobaktériumok által termelt hatóanyagok neurotoxikus hatását jelzik.
A cianobaktérium törzsek akut hatásának elemzése szubletális koncentrációban a Dikerogammarus villosus amphipoda rákon az LDH enzim aktivitás jelentős megnövekedését okozta, és a hatás mértéke erőteljes dózisfüggést mutatott. Az ACT 9502, ACT 9504, valamint PCC 6506-os törzsekkel kezelt rákoknál, a korábbi sórák naupliákkal végzett vizsgálatok eredményeivel egyezően, szignifikáns acetilkolineszteráz gátlás volt észlelhető, ami a cianobaktériumok által termelt hatóanyagok neurotoxikus hatását jelzik. Az AQS, valamint az ACT 9503 és ACT 9505 törzsek kivonatai nem váltottak ki szignifikáns hatást az acetilkolineszteráz aktivitásra.
Az amphipoda rákokkal végzett akut vizsgálatok legjelentősebb eredménye az, hogy bár az ökotoxicitási tesztekben a cilindrospermopszin termelő AQS törzs nagyságrenddel bizonyult toxikusabbnak, mint a balatoni, és a PCC 6506-os törzsek, a 10 mg/l dózisban (ami az 1994-ben bekövetkezett balatoni C. raciborskii tömegprodukcióval egyező állapotnak felel meg) még az AQS sem okozott szignifikáns pusztulást a tesztállatokban, illetve, jelentősebb hatást a biokémiai marker enzimek aktivitásában.
A cianobaktérium minták analitikai elemzése az AQS törzs cilindrospermopszin termelését mutatta ki nagy mennyiségben (12,7 mg/g). A PCC 6506 mintánál mindkét anatoxin homológ termelése igazolódott, az irodalomban leírt mennyiségi különbségekkel egyezően (anatoxin-a: 124 μg/g; homonatoxin-a: 3,2 mg/g). A balatoni
87 alga liofilizátumok analitikai elemzése alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a törzsek ismert toxinokat nem termelnek.
A toxinmennyiségek ismeretében a toxicitási tesztek során nyert adatok összevethetőek az szakirodalomban leírt értékekkel. A. salina kisrákra a tisztított cilindrospermopszin EC50 értéke 2,86 mg/l, míg az anatoxin-a EC50 értéke A. salina esetében 2-14 mg/l körül mozog, mely megegyezik a homoanatoxin-a-ra mért értékekkel (Metcalf et al. 2002;
Devlin et al. 1977).
9. táblázat. Az ökotoxicitási tesztek eredményei toxintartalomban kifejezve (mg/l) V. fischeri
(ToxAlert100)
D. magna (Daphtoxkit F)
A. salina(ArTox) T. platyurus (Thamnotoxkit F) PCC
6506 3,99 4,25 7,68 20,416*
AQS 2,17 1,40 2,92 9,216*
*μg/l
10. táblázat. Daphnia magna vizsgálatok eredménye az algakivonatokra, toxin-ekvivalensben kifejezve (mg/ml)
Az eredmények alapján megállapítható, hogy az általunk mért értékek megegyeznek az irodalom által leírt értékkel (9. és 10 táblázat).
Az alkalmazott ökotoxikológiai tesztek a cianobakteriális toxicitás környezeti kockázatának elemzése során a citotoxikus és hepatotoxikus cilindrospermopszin kimutatására megbízható eljárásoknak bizonyultak. A neurotoxikus cianobakteriális metabolitok jelenlétének kimutatására a klasszikus letalitási assay eljárások nem mutattak megfelelő érzékenységet, így a neurotoxinok detektálására az egérteszt mellett, megbízható alternatívát jelentenek az in vitro immunkémiai detektálási eljárások, mint az in vitro AChE gátlás teszt, vagy a specifikus ELISA assay-k. A cianobakteriális tömegprodukció környezeti kockázatának biztonságos felmérésére továbbra is új eljárások kidolgozására van szükség, melyek nagyszámú minta biztonságos, gyors és gazdaságos elemzését biztosítják. A PhD munkám eredményei a hazai cianobaktérium fajok másodlagos anyagcsere termékeinek további kutatásának fontosságát is hangsúlyozzák, ugyanis részeredményeink nagyszámú kémiai komponensek termelését
88 jelzik a balatoni C. raciborskii fajok esetében is, melyek szerkezeti azonosítása és bioaktív tulajdonságaiknak meghatározása jövő kutatások feladata marad. A téma aktualitását nem csak humán egészségi és környezetvédelmi szempontok indokolják, de felvetődik annak a lehetősége is, hogy az eddig még azonosítatlan cianobakteriális metabolitok akár gazdaságilag fontos vegyületek is lehetnek, és alkalmazást találnak a gyógyszergyártásban, vegyiparban vagy, mint már arra van példa, új energiaforrást is jelenthetnek.
89
Tézispontok
1. Új eljárást fejlesztettem ki xenobiotikumok környezeti kockázatbecslésére, amellyel az anyaghatást a Daphnia magna táplálkozás aktivitásában bekövetkezett gátlás alapján minősíthető. A teszt a szubletális anyaghatások becslésére alkalmas, és egy viselkedés-élettani végpont mérésén alapul. Az új módszer előnye az emberi szubjektivitásból adódó tévedés lehetőségének kiküszöbölése, ezen felül a táplálkozás aktivitás gátlása ökológiai szempontból sokkal relevánsabb és specifikusabb végpontot jelent.
2. Szoftveres képelemzési módszert fejlesztettem ki a hitelesített Lemna minor növekedés-gátlás teszt adatainak kiértékelésére, amely kiküszöböli az emberi szubjektivitásból adódó növényi fejlődés változások becslésének bizonytalanságát. Az új eljárás kalibrációja során kálium-bikromáttal számottevően kisebb szórást találtunk a párhuzamos vizsgálatok adatai között.
3. Az alkalmazott ökotoxicitási tesztek a cianobakteriális toxicitás környezeti kockázatának becslése során, a legnagyobb toxicitást a cilindrospermopszint termelő C. raciborskii (AQS) törzsre jelezte. A balatoni C. raciborskii, valamint az anatoxinokat termelő Oscillatoria sp. (PCC 6506) törzseknél minden teszt számottevően kisebb különbségeket jelzett a toxicitás mértékében. Valamennyi teszt azonos trendet mutatott a cianobaktérium törzsek toxicitásának mértékében.
4. Számottevő különbségek az ökotoxicitási vizsgálatok során a metodikák gyakorlati kivitelezésében jelentkeztek, így a legnagyobb hatékonyság a Vibrio fisheri és Daphnia magna táplálkozás-aktivitás tesztre jellemző, a rövid kivitelezési idő, ill., nagyobb pontosság miatt. A legérzékenyebb eljárásnak a Thamnocephalus platyurus teszt bionyult. Az Artemia salina és a Daphnia magna immobilitás teszt érzékenysége a Vibrio fisheri módszerével közel azonos, az elemzés lényegesen hosszabb időtartama miatt azonban, ha csak az általános toxikus hatásbecslés a cél, az immobilizációs tesztek kevésbé előnyösek.
90 5. Kifejlesztettem egy teszteljárást, amelyben az Artemia salina akut toxicitási teszt során párhuzamosan meghatározható mind a toxikus anyagok letalitási mutatója (LC50), egyben az expozíciót túlélő naupliák, biokémiai enzimatikus marker vizsgálatokba vonhatók. Az expozíciót túlélő sórák naupliák egyszerű szűréssel és mosással elkülöníthetők és a biokémiai vizsgálatokig fagyasztva tárolhatók.
6. A sórák naupliák GST aktivitásának változásai hűen tükrözték az AQS C.
raciborskii vizes kivonatában a cilindrospermopszin jelenlétét, melynek toxicitása proteinszintézis gátlásban nyilvánul meg. Az exponált sórák naupliákban észlelt változó mértékű LDH aktivitás növekedés mértéke szoros pozitív korrelációt mutatott a nyers cianobaktérium kivonatok általános toxicitási mutatójával. Az acetilkolineszteráz enzimaktivitásban észlelt változások, néhány cianobaktérium kivonat esetében antikolineszteráz tulajdonsággal rendelkező metabolitok szintézisét jelzi.
7. A Dikerogammarus villosus amphipoda rákokkal végzett akut vizsgálatok legjelentősebb eredménye az, hogy a természetben is gyakran előforduló tömegprodukció, még az egzotikus AQS C. raciborskii (cilindrospermopszin termelő) ill. PCC 6506 Oscillatoria sp. (anatoxinokat termelő) fajok sem jelentenek számottevő környezeti kockázatot a vízi ökoszisztéma élőlény együtteseire.
8. A mortalitási tesztek kiválthatóak szubletális végpontú eljárások által. A mellett, hogy utóbbiak érzékenyebbnek, pontosabbnak bizonyultak, ökológiai relevanciájuk alapján megfelelőbben extrapolálhatók az ökoszisztémára nézve.
További fontos előnyük, hogy a megfelelően kiválasztott módszereket egymással kombinálva fontos többletinformációkat nyerhetünk a bioaktív anyagok hatásmechanizmusát illetően.
9. A cianobaktérium minták analitikai elemzése az AQS törzs cilindrospermopszin termelését mutatta ki nagy mennyiségben (12,7 mg/g). A PCC 6506 mintánál mindkét anatoxin homológ termelése igazolódott, az irodalomban leírt mennyiségi különbségekkel egyezően (anatoxin-a: 124 μg/g; homoanatoxin-a:
3,2 mg/g). A balatoni alga liofilizátumok analitikai elemzése alapján azt a
91 következtetést vonhatjuk le, hogy a törzsek a közismert cianotoxinokat nem termelik.
92
Theses
1. I have developed a new method feasible for assessing the environmental risks of xenobiotocs, in which the effects of a target compound is rated upon the inhibition induced in the feeding activity of Daphnia magna. The test is feasible for the evaluation of sub-lethal effects, and is based on the measurement of a behavioral endpoint. Advantages of the new method rely in that human subjectivity sourced errors are excluded; moreover inhibition of the feeding activity is a much more specific endpoint from ecological point of view.
2. I have developed a new evaluation method of data processing for the standard Lemna minor growth inhibition assay, using software image analysis, which reduces the inaccuracy caused by human subjectivity during the estimation process of plant growth changes. Calibration results towards potassium-dichromate obtained by software analysis between parallel tests showed significantly lower standard deviation, than in case of manual evaluation.
3. The conventional ecotoxicity assays showed highest toxicity for the cylindrospermopsin producing C. raciborskii strain (AQS). For the strains isolated from Lake Balaton and the Oscillatoria sp. strain (PCC 6506) producing anatoxins, all assays revealed significantly lower differences in toxicity. All assays showed similar trend within the toxic effects of the cyanobacterial strains.
4. Main differences were noticeable in the practical applicability of the different methods. The efficiency of Vibrio fischeri bioluminescence inhibition test and Daphnia magna feeding inhibition test were the highest, owing to their short execution time and high accuracy. The Thamnocephalus platyurus assay showed the highest sensitivity towards bioactive effects of cyanobacterial extracts. The sensitivity of Daphnia magna and Artemia salina assays were basically identical with that of the Vibrio fischeri test, however, due to their longer execution time, if the general toxicity of a compound is aimed, the immobilization assays are less advantageous.
5. I have developed a test method, based on the Artemia salina lethality assay, in which changes of biochemical biomarker enzymes are traceable in parallel with
93 the determination of mortality rates (LC50) caused by toxic agents, using the surviving nauplii. The surviving test organisms can be easily separated through filtration and rinsing, and are storable deep-freezed until use.
6. The GST activity changes in the Artemia salina nauplii, caused by the extracts of the AQS strain mirrored the presence of cylindrospermopsin, which exerts influence on protein synthesis. Increases in LDH activities showed close positive correlation with the general toxicity of the cyanobacterial extracts. Changes in acetyl cholinesterase activity are indicative of AChE inhibiting metabolites in the case of some cyanobacterial extracts.
7. The most important outcome of the acute assays performed on Dikerogammarus villosus, is that by naturally occurring masses of cyanobacteria, not even the cylindrospermopsin producer C. raciborsikii strain (AQS) and the anatoxins producer Oscillatoria sp. strain (PCC 6506) pose significant environmental hazard on living organisms inhabiting the aquatic ecosystem.
8. My investigations revealed that the conventional lethality assays can be substituted by test alternatives relying on sub-lethal endpoints. These alternative assays proved to be more sensitive, reliable, and upon their ecological relevance, can be better extrapolated to the ecosystem. Another relevant advantage is their applicability in battery of assays providing in this way important extra information about the mechanisms of action bioactive compounds.
9. Chemical analysis of the cyanobacterial strains revealed the production in high amounts (12,7 mg/g) of cylindrospermopsin by the AQS strain. In extracts of the Oscillatoria sp. strain (PCC 6506) both anatoxin homologues were detectable, in similar amounts as described by the literature (anatoxin-a: 124 μg/g;
homoanatoxin-a: 3,2 mg/g). Analysis of lyophilized algal material of cyanobacteria isolated from Lake Balaton revealed the absence of all known cyanotoxins.
94
Irodalomjegyzék
Aboal, M., M. Angeles Puig, P. Mateo, E. Perona. „Implications of cyanophyte toxicity on biological monitoring of calcareous streams in north-east Spain.” Journal of Applied Phycology 14, 2002: 49-56.
Akasofu, S., M. Kimura, T. Kosasa, H. Ogura, K. Sawada. „Protective effect of donepezil in primary-cultured rat cortical neurons exposed to N-methyl-D-aspartate (NMDA) toxicity.” Eur. J. Pharmacol. 530, 2006: 215-222.
Anonímusz „Chapter I, Summary, Policy Issues, and options for Congressional Action.”
In Alternatives to Animal Use in Research,Testing, and Education, Annon, 4-34.
Washington, DC: U.S. Government Printing Office, 1986.
Anonímusz „The ethics of research involving animals.” In Ch. 11 Replacements, 187-201. London: Nuffield Council on Bioethics, 2005.
Anonímusz White paper. Brüsszel: Europian Commission, 2001.
Araoz, R.; Guérineau, V.; Rippka, R.; Palibroda, N.; Herdman, M.; Laprevote, O.;
Döhren, H.; Marsac, N. T., Erhard, M. „MALDI-TOF-MS detection of the low molecular weight neurotoxins anatoxin-a and homoanatoxin-a on lyophilized and fresh filaments of axenic Oscillatoria strais.” Toxicon 51, 2008: 1308-1315.
Aráoz, R., J. Molgo, N. T. de Marsac. „Neurotoxic cyanobacterial toxins.” Toxicon doi:10.1016/j.toxicon.2009.07.036, 2009: 1-16.
Aune, T., K. Berg. „Use of freshly prepared rat hepatocytes to study toxicity of blooms of blue-green algae Microcystis aeruginosa and Oscillatoria agardhii.” J. Toxic.
Environ. Health, 19. szám (1986): 325-336.
Baganz, D., G. Staaks, C. Steinberg. „Impact of the cyanobacteria toxin, microcystin-LR on behaviour of zebrafish, Danio rerio.” Wat. Res. 32, 1998: 948-952.
Baird, D. J., A. M. V. M. Soares, A. E. Girling, I. Barber, M. C. Bradley, P. Calow.
„The long-term maintenance of Daphnia magna for use in ecotoxicity tests:
Problems and prospects.” Szerkesztette: H. Lokke, H. Tyle, F. Bro-Rasmussen.
Lyngby, Denmark, 1989. 144-148.
Beattie, K. A.; Ressler, J.; Wiegand, C.; Krause, E.; Codd, G. A.; Steinberg, C. E., Pflugmacher, S. „Comparative effects and metabolism of two microcystins and nodularin in the brine shrimp Artemia salina.” Aquat. Toxicol. 62, 2003: 219–
226.
Berry, J. P., P. D. L. Gibbs, M. C. Schmale, M. L. Saker. „Toxicity of cylindrospermopsin, and other apparent metabolites from Cylindrospermopsis raciborskii and Aphanizomenon ovalisporum, to the zebrafish (Danio rerio) embryo.” Toxicon 53, 2009: 289–299.
Blom, J. F., J. A. Robinson, F. Jüttner. „High grazer High grazer toxicity of [D-Asp3,(E)-Dhb7]microcystin-RR of Planktothrix rubescens as compared to different microcystins.” Toxicon 39, 2001: 1923-1932.
Botha, N., M. M. Gehringer, T. G. Downing, M. van de Venter, E. G. Shephard. „The role of microcystin-LR in the induction of apoptosis and oxidative stress in CaCo2 cells.” Toxicon 43, 2004: 85-92.
Bradford, M. M. „A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.” Anal.
Biochem., 72, 1976: 248-254.
Brock, T. D. „Evolutionary and ecological aspects of the cyanophytes.” In The Biology of the Blue-Green Algae, N. G. Carr, B. A. Whitton, 487-500. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1973.
95 Burns, C. W. „The Relationship Between Body Size of Filterfeeding Cladocera and the Maximum Size of Particle Ingested.” imnology and Oceanography 13, 1968:
675-678.
Campbell, D. L., L. A. Lawton, K. A. Beattie, G. A. Codd. „Comparative assessment of the specificity of the brine shrimp and Microtox assay to hepatoxic (microcystin-LR-containing) cyanobacteria.” Environ. Toxicol. Water Qual., 9. szám (1994):
71-77.
Carmichel, W. W., J. T. Eschedor, G. M. L. Patterson, R. E. Moore. „Toxicity and partial structure of a hepatotoxic peptide produced by the cyanobacterium Nodularia spumigena Mertens.” Appl. Env. Microbiol. 54, 1988: 2257-2263.
Carpenter, E. J.; D. G. Capone, J. G. Reuter „Marine Pelagic Cyanobacteria:
Trichodesmium and other Diazotrophs.” In NATO ASI Series C, Mathematical and Physical Sciences, Vol. 362., E. J. Carpenter, D. G. Capone, J. G. Reuter.
Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1992.
Castenholz, R. W., J. B. Waterbury. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.
Vol. 3, J. T. Staley, M. P. Bryant, N. Pfennig, J. G. Holt, 1710-1727. Baltimore:
Williams & Wilkins, 1989.
Cembella, A. D., L. Milenkovic, G. Doucette, M. Fernandez. „In Vitro biochemical methods and mammalian bioassays for phycotoxins.” In Manual on Harmful Marine Microalgae, IOC Manuals and Guides No. 33, szerkesztette: G. M.
Hallegraeff, D. M. Anderson, A. D. Cembella, 177-211. Paris: United Nations Educational, Scientific and Cultural Organization, 1995.
Chapman, P. M. „Integrating toxicology and ecology: putting the "eco" into ecotoxicology vol. 44, no. 1.” Marine Pollution Bulletin, 2002: 7-15.
Chen, J., P. Xie. „Seasonal dynamics of the hepatotoxic microcystins in various organs of four freshwater bivalves from the large eutrophic lake Taihu of subtropical China and the risk to human consumption.” Environ. Toxicol. 20, 2005: 572–
584.
Choi, B. W.; Namikoshi, M.; Sun, F.; Rinehart, K. L.; Carmichael, W. W.; Kaup, A. M.;
Evans, W. R., Beasley, V. R. „Isolation of linear peptides related to the hepatotoxins nodularin and microcystins.” Tetrahedron Letters, 34, 1993: 7881-7884.
Chorus, I., J. Bartram. „Toxic Cyanobacteria in Water: a Guide to Public Health Significance, Monitoring and Management.” Monitoring and Management. Für WHO durch E & FN Spon /Chapman & Hall, London, 416., 1999.
Codd, G. A., S. G. Bell, K. Kaya, C. J. Ward, K. A. Beattie, J. S. Metcalf.
„Cyanobacterial toxins, exposure routes and human health.” European Journal of Phycology 34, 1999: 405-415.
Dahlmann, J., A. Rühl, C. Hummert, G. Liebezeit, P. Carlsson, E. Granéli. „Different methods for toxin analysis in the cyanobacterium Nodularia spumigena (Cyanophyceae).” Toxicon 39, 2001: 1183-1190.
Dao, T. S., L. C. Do-Hong, C. Wiegand. „Chronic effects of cyanobacterial toxins on Daphnia magna and their offspring.” Toxicon 55, 2010: 1244–1254.
Davido, S. R., P. A. Fontelo. „A competitive displacement assay to detect saxitoxin and tetrodotoxin.” Analyt. Biochem., 141. szám (1984): 199-204.
Decker, T., M. L. Lohmann-Matthes. „A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity.” J. Immunol. Methods. 115, 1989: 61-69.
96 DeMott, W. R., Q. X. Zhang, W. W. Carmichael. „Effects of toxic cyanobacteria and purified toxins on the survival and feeding of a copepod and three species of Daphnia.” Limnol. Oceanogr. 36, 1991: 1346-1357.
Dewes, L. J., J. Z. Sandrini, J. M. Monserrat, J. S. Yunes. „Biochemical and physiological responses after exposure to microcystins in the crab Chasmagnathus granulatus (Decapoda, Brachyura).” Ecotoxicology and Environmental Safety, 2006: 201-208.
Dhananjaya, S. P., A. Kumar, M. B. Tvagi. „Biotoxic cyanobacterial metabolites exhibiting pesticidal and mosquito larvicidal activities.” Journal of microbiology and biotechnology 13, 2003: 50-56.
Diamantino, T. C., E. Almeida, A. M. V. M. Sores, L. Guilhermino. „Lactate dehydrogenase activity as an effect criterion in toxicity tests with Daphnia magna straus.” Chemosphere 45, 2001: 553-560.
Dias, D.; Andrade, M.; Alverca, E.; Pereira, P.; Batoréu, M. C. C.; Jordan, P., Silva, M.
J. „Comparative study of the cytotoxic effect of microcistin-LR and purified extracts from Microcystis aeruginosa on a kidney cell line.” Toxicon 53, 2009:
487-495.
Dierstein, R., I. Kaiser, J. Weckesser. „Inhibition of prodigiosin formation in Serratia marcescens by extracts of toxic cyanobacteria.” System. Appl. Microbiol., 12.
szám (1989): 244-248.
Ding, W. G., H. M. Shen, H. G. Zhu, C. N. Ong. „Studies on Oxidative Damage Induced by Cyanobacteria Extract in Primary Cultured Rat Hepatocytes.”
Environmental Research, 1989: 12-18.
Dong, W.; Simeonova, P. P.; Gallucci, R.; Matheson, J.; Flood, L.; Wang, S.; Hubbs, A., Luster, M. I. „Toxic metals stimulate inflammatory cytokines in hepatocytes through oxidative stress mechanisms.” Toxicol. Appl. Pharmacol. 151, 1989:
359-366.
Eaton, D. L., C. D. Klaassen. „Principles of toxicology.” In casarett and doull’s toxicology: the basic science of poisons, C. D. Klaassen, 11-34. London:
McGraw-Hill Medical Publishing Division, 2001.
Ellman, G. L., K. D. Courtney, K. D. Andres, R. M. Featherstone. „A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity.” Biochemical Pharmacology 7, 1961: 88–95.
Entz, G., J. Kottász, O. Sebestyén. „Quantitatív tanulmányok a Balaton bioszesztonján.”
Annal. Biol. Tihany 9, 1937: 1-144.
Fastner, J., R. Heinze, A. R. Humpage, U. Mischke, Eaglesham, G. K. U., I. Chorus.
„Cylindrospermopsin occurrence in two German lakes and preliminary assessment of toxicity and toxin production of Cylindrospermopsis raciborskii (Cyanobacteria) isolates.” Toxicon 42, 2003: 313-321.
Fay P., C. Van Baalen, The Cyanobacteria, 534. Amsterdam: Elsevier, 1987.
Fogg, G. E. „Harmful algae–a perspective.” Harmful algae 1, 2002: 1–4.
Frasco, M. F., L. Guilhermino. „Effects of dimethoate and betanaphthoflavone on selected biomarkers of Poecilia reticulata.” Fish Physiology and Biochemistry 26, 2002: 149–156.
Furey, A., J. Crowley, A. N. Shuilleabhain, O. M. Skulberg, K. J. James. „The first identification of the rare cyanobacterial toxin, homoanatoxin-a, in Ireland.”
Toxicon 41, 2003: 297-303.
Furey, A., J. Crowley, B. Hamilton, M. Lehane, K. J. James. „Strategies to avoid the mis-identification of anatoxin-a using mass spectrometry in the forensic
97 investigation of acute neurotoxic poisoning.” Journal of Chromatography 1082,
97 investigation of acute neurotoxic poisoning.” Journal of Chromatography 1082,