A kb. 5 perces DNS mintavételi eljárás során (lásd 7.1 melléklet) a személyek arcuk belső felületéről egy vattapálcával néhány perces dörzsöléssel vettek le szájhámsejteket. Minden személy legalább két, független mintát adott (pl. NC743A és NC743B jelű minták) melyeket mélyhűtőben tároltunk, majd a Semmelweis Egyetem Molekuláris Genetikai Laboratóriumába szállítottuk. Az „A” és „B” mintákból kollaboráló munkatársaink külön-külön tisztították a DNS-t (Boor és mtsai., 2002), így ha az izolálás valamilyen okból nem sikerült, általában rendelkezésünkre állt a másik minta. A mintavételi eljárás sajátosságaiból adódóan ritkán, de előfordult, hogy csak nagyon kevés sejt volt a mintavételi pálcán, így nem sikerült a genetikai profil meghatározásához elegendő DNS-t izolálni. Olyan eset is előfordult, hogy a személy utólag visszavonta a DNS vizsgálatban történő részvételét, biológiai mintáját ez esetben megsemmisítettük. A laboratórium az izolált és kódolt DNS mintákat -20Co-on (mélyhűtőben) tárolja. Az egyes személyek kódszámaihoz általában többféle polimorfizmus genotípus adatai tartoznak, ez polimorfizmusonként mindig két szám vagy két betű az alléloknak megfelelően.
A statisztikai elemzések során a szakmai kérdéshez kapcsolódó részletes fenotípusos jellemzés adatait egyesítettük a megfelelő genetikai adatokkal, azaz egy vagy több polimorfizmus genotípus értékeivel. A felhasznált fenotípusos és genetikai adatok megbízhatóságát minden
esetben ellenőriztük, melynek alapelveit az alábbi fejezetekben, az egyes vizsgálatokhoz kapcsolódó eredményeket pedig a 3.3 - 3.9 fejezetekben mutatom be.
3.1.1 A genetikai adatok megbízhatósága
A genetikai profilban a személyek vizsgált polimorfizmusainak genotípusai szerepelnek.
Minden egyes genotípus két betű vagy két szám. De vajon mennyire megbízhatók ezek az adatok? Az egyik módszertani buktató maga a mintavételezés, melynek talán leglényegesebb tényezője az, hogy a vizsgált biológiai minta valóban az adott személy, és kizárólag az adott személy DNS állományát tartalmazza megfelelő mennyiségben és minőségben. A vérmintából történő elemzés kézenfekvő, ha a személyektől –valamilyen orvosi beavatkozás miatt– amúgy is vennének vért. Azonban egészséges önkéntesek pszichogenetikai vizsgálataihoz lényegesen egyszerűbb, higiénikusabb, és olcsóbb a nem invazív (szájhámsejtből történő) mintavételi eljárás, melyet neves kutatók már húsz évvel ezelőtt is javasoltak (Freeman és mtsai., 1997).
Mára már vizsgálatok ezrei használják ezt a számunkra is bevált módszert, melynek azonban néhány alapvető technikai buktatója (Giamanco, C. M., 2008) gyakran okoz fejtörést. Az adatokat felvevő és a mintavételt irányító vizsgálatvezetők kapnak egy mintavételi protokollt, melynek részeként meg kell győződni például arról is, hogy levett minta esetleg nem fertőzött-e fertőzött-egy másik humán DNS-fertőzött-el (pl. a szfertőzött-emély nfertőzött-em fogyasztott-fertőzött-e anyatfertőzött-ejfertőzött-et, vagy nfertőzött-em csókolózott-e a mintavétcsókolózott-elt mcsókolózott-egcsókolózott-előző kb. 60 pcsókolózott-ercbcsókolózott-en, stb.). A mintavétcsókolózott-el protokoll szcsókolózott-erinti csókolózott-elvégzéscsókolózott-e azért is fontos, hogy megfelelő legyen a szájhámsejtekből nyerhető DNS mennyisége és minősége (Mahfuz, Cheng, és White, 2013) mert a túl kevés vagy rossz minőségű minta befolyásolhatja a genotipizálás eredményeit. A genetikai meghatározás megfelelő módszerének kiválasztása szintén kulcsfontosságú. Például előfordulhat, hogy a jelen disszertációban is tárgyalt dopamin D4-es receptor egyik polimorfizmusának heterozigóta formáját homozigótaként azonosítják a korábbi módszerekkel, ez az úgynevezett allél kiesés. Ezeknek a hibáknak az elkerüléséhez a Semmelweis Egyetemen dolgozó kollégáink is hozzájárultak megfelelő genotipizálási eljárások kidolgozásával (Ronai és mtsai., 2000, 2004). Szokás továbbá két, alternatív módszerrel meghatározni a genotípust, melyet a Molekuláris Genetikai Laboratórium rutinszerűen alkalmaz, különösen az új módszerek bevezetésénél.
A kérdőívek pszichometriai vizsgálataihoz hasonlóan, populációs szinten is lehetséges a genetikai adatok megbízhatóságának tesztelése. Ilyen a kapott genetikai adathalmaz Hardy–
Weinberg egyensúlyának tesztelése. Ha nincs szelekciós nyomás, azaz nem kifejezetten káros vagy hasznos egyik allél sem, akkor az egyes genotípus frekvenciák értékei a mért allél
frekvenciából kiszámíthatók (Hardy, 1908). Ha a számított genotípus gyakoriság és a mért genotípus gyakoriság jól egyezik, akkor a minta egy genetikai egyensúlyban lévő populációt reprezentál. Az egyezés egyben a genotipizáláshoz használt molekuláris genetikai módszer megbízhatóságát is igazolja.
SNP-k esetében tipikusan 2 féle allél fordul elő, ennek gyakoriság értékeit p és q-val szokás jelölni. Ha egy adott polimorfizmusnak több mint két variánsa van, ami gyakori a hosszúság polimorfizmusoknál, akkor a két, leggyakoribb allél alapján szokás tesztelni a Hardy–
Weinberg egyensúly meglétét. A mért allélfrekvenciákból egyszerű szorzással számoljuk ki a genotípus gyakoriság elméleti értékeit (4. táblázat).
4. táblázat. Genetikai adatok megbízhatóságának tesztelése a Hardy–Weinberg egyensúly alapján
A táblázatban egy CT SNP szerepel példaként, ahol az egyik allélt C-vel, a másik allélt T-vel jelöljük. Az egyensúly feltételezi, hogy az ivarsejtekben található allélok az utódokban véletlenszerűen találkoznak. A táblázat adatai alapján C találkozása C-vel p x p = p2 valószínűséggel jön létre, tehát a CC genotípus elméleti gyakorisága p2, ugyanígy a TT genotípus elméleti gyakorisága q2.C és T allélokat tartalmazó heterozigóta ivarsejtek kombinációjának valószínűsége 2pq, ezen felül más esemény nem lehetséges, így ezek összege 1. Ha a Hardy–Weinberg egyensúly a vizsgálati mintában érvényesül, ez igazolja a genotipizálási módszer megbízhatóságát, valamint a minta homogenitását. Ha az egyensúly nem érvényesül, akkor általában az alkalmazott genotipizálási módszert érdemes felülvizsgálni.
A Hardy–Weinberg egyensúly feltétele, hogy a mért genotípus gyakoriságok (melyeket x, y és z jelöl a 4. táblázatban nem térnek el szignifikánsan az allél gyakoriságokból számított elméleti genotípus gyakorisági értékeitől (melyeket p2, 2pq és q2 jelöl a 4. táblázatban). A bemutatásra kerülő valamennyi pszichogenetikai vizsgálatban Khi négyzet próbák alapján teszteltük a Hardy–Weinberg egyensúlyt.
3.1.2 A vizsgálatokban alkalmazott allél, genotípus és haplotípus kategóriák
Az allél és genotípus alapú elemzések logikáját a 2.2.1.1 fejezet mutatja be. A statisztikai elemzés szempontjából kritikus a különböző genotípusok megfelelő csoportosítása (összevonása), hiszen előfordul, hogy egy génváltozat annyira ritka, hogy nem érdemes külön
allélok C T
mért gyakoriságok p q p+q=1
genotípusok CC CT TT
elméleti gyakoriságok p2 2pq q2 p2+2pq+q2 = 1
mért gyakoriságok x y z
csoportként kezelni. Ráadásul az ismétlődési polimorfizmusok a genotípusok száma gyakran jóval több, mint három, így szükségszerű a csoportosítás. A szakirodalomban változatos módon csoportosítják a genotípusokat, és ezek az eltérések gyakran megnehezítik az eredmények összehasonítását (lásd pl. a DRD4 VNTR témájában készült összefoglalót: Pappa és mtsai., 2015). A jelen dolgozatban minden polimorfizmus esetében ugyanazt a csoportosítást alkalmaztam, melyeket az Eredmények részben részleteztek.
SNP-k esetében maximum 3 genotípus kategóriával számolhatunk (4. táblázat). Ez akkor jó megoldás, ha a heterozigóta genotípus fenotípusos értékei a két homozigóta közé esnek, ami intermedier öröklésmenetre vagy kodominanciára utal. Előfordul azonban, hogy a heterozigóta csoport fenotípusos hasonlósága alapján összevonható valamelyik homozigóta csoporttal domináns vagy recesszív öröklődés esetében. A 4. táblázat példája alapján a C allél dominanciáját feltételezve összevonható a CC és a CT csoport, amennyiben e két utóbbi csoport fenotípusos értékei nem különböznek lényegesen. Az így kialakított, összevont genotípus kategóriák használata a szakirodalomban általánosan elfogadott. Ritkán előfordul a heterozigóta csoport kiemelése és a két homozigóta kategória összevonása is. Ez az összevonási mód azonban biológiai szempontból nem jól értelmezhető, de ha szakmailag indokolt, használható. A szakirodalomban találunk példát ilyen elemzési elrendezésre is, azonban a jelen disszertációban ilyen összevonást nem alkalmaztam.
VNTR-ek esetében a helyzetet komplikálja, hogy általában kettőnél több allélváltozatuk van.
Így ezek kombinálódásával nagyon sokféle genotípus jöhet létre (lásd 5. táblázat). Azonban bármennyi is a lehetséges allélok száma, általában egy vagy két allél a gyakori, a többi nagyon ritka. A ritka allélokat nem ajánlatos teljesen kihagyni az elemzésből, mert ez irányítottan torzítja az adatokat. Ehelyett összevonásokat használunk.
Allélok 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 2,10 3 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 3,10
4 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9 4,10
5 5,5 5,6 5,7 5,8 5,8 5,10
6 >40% 6.6 6,7 6,8 6,9 6,10
7 >20% 7,7 7,8 7,9 7,10
8 >10% 8,8 8,9 8,10
9 >2% Genotípusok 9,10
10 >1% 10,10
5. táblázat. A DRD4 VNTR lehetséges genotípusainak gyakorisága
A táblázat vízszintes és függőleges fejlécében a lehetséges allélok vannak feltüntetve; a szám az ismétlődő egységek számát jelenti. A genotípus elvben két, tetszőleges allél kombinációját jelenti.
Az ábrán sötétebb kiemelés jelöli a gyakoribb genotípusokat, a 7-es allélt tartalmazó genotípusokat vastagon szedtem.
Az 5. táblázat bemutatja a DRD4 VNTR ismert alléljait és elvben lehetséges genotípusait. Itt a leggyakoribb allél a 4-es, a második leggyakoribb a 7 ismétlődést tartalmazó forma. Érdemes megegyezni, hogy a szakirodalmi eredmények alapján a 7-es a legérdekesebb változat, melynek jelenléte a személyekben számos fenotípusos jelleggel asszociál. Ezért a DRD4 genotípusok leggyakoribb, a szakirodalomban általánosan elfogadott felosztása annak alapján történik, hogy az adott személy hordozza-e 7-es allélt akár heterozigóta, akár homozigóta formában („van 7-es”), vagy nem hordozza („nincs 7-es”). Emellett persze más csoportosítás is lehetséges.