Az asszociáció vizsgálatokkal kapcsolatos legfontosabb kritika mind a kandidáns génvizsgálatok, mind pedig a GWAS eredmények változó reprodukálhatósága. Az inkonzisztens eredmények publikációját gyakran követi intenzív vita az ellentmondások forrásáról (Paterson, Sunohara, G A, és Kennedy, J L, 1999). Így alakultak ki fokozatosan az asszociáció vizsgálatok módszertanával kapcsolatos alapvető elvárások, melyek magukba foglalják például a helyes mintavételi eljárásokat, a genetikai módszer megbízhatóságának ellenőrzését és a megfelelő fenotípusos adatfelvételt.
2.2.2.1 Hamis pozitív eredmények és a többszörös tesztelés problémaköre
Egy pszichogenetikai asszociációt bemutató első eredményt tipikusan több ellentmondó eredmény követ, melynek igen sokféle oka lehet. A statisztikai hipotézis-vizsgálat elsőfajú hibája a hamis pozitív eredmény, melyet okozhat például a többszörös tesztelés során kapott
„véletlenül” szignifikáns asszociáció (McDonald, 2014; Petschner, Bagdy, és Tóthfalusi, 2015).
Ha az első vizsgálatot viszont sikerül egy független mintán megismételni, hihetetlen mértékben lecsökken annak valószínűsége, hogy mindkét esetben csupán „véletlenül” szignifikáns genetikai összefüggést mutattunk ki. Kutatócsoportunkban éppen ezért sokéves gyakorlat, hogy a szignifikáns genetikai összefüggések érvényességének gyors tesztjeként a kereszt-validálás módszerét alkalmazzuk (Geisser, 1975). A mintát random félbe vágva megvizsgáltuk, hogy vajon a minta mindkét felén megmutatkozik-e ugyanaz az irányú genetikai összefüggés (még ha az összefüggés esetleg nem is lesz a minta mindkét felén szignifikáns).
A genetikai módszerek rohamos fejlődésével az utóbbi időben párhuzamosan nőtt az egy-egy tanulmányban vizsgált genotípusok száma (Weir és Laurie, 2010). A kandidáns génvizsgálatokban ma már egyszerre több gént, vagy egy gén több polimorfizmusát szokás
vizsgálni. Nem beszélve a teljes genom vizsgálatokról, ahol egyszerre akár egymillió polimorfizmust is tesztelhetnek. Így a pszichogenetikai asszociációvizsgálatok eredményeit bemutató közlemények mára már „kötelező eleme” a többszörös tesztelésre való korrekció, mely leggyakrabban a rendkívül rigorózus Bonferroni korrekciót jelenti (Dunn, 1961). Ez az eljárás ugyan valóban drasztikusan lecsökkenti a statisztikai hipotézis-vizsgálatok I.-fajú hibájából adódó hamis pozitív eredmények valószínűségét, ugyanakkor egyben erőteljesen megnöveli a II.-fajú hiba valószínűségét is, melynek következtében gyakran nem realizálódik egy valójában létező asszociáció (Perneger, 1998).
2.2.2.2 Mintavételi torzítások
A populáció stratifikációból eredő problémák
„Egyszer volt, hol nem volt, volt egyszer egy etnogenetikus, aki arra volt kíváncsi, hogy egyesek miért esznek pálcikával, mások miért nem…” E mondattal kezdődik, és egy rendkívül kedves példamesével folytatódik a pszichogenetikai asszociációvizsgálatok egyik legfontosabb módszertani cikke, mely „Vigyázz a pálcikával való evés génjével” címmel az egyik legrangosabb folyóirat, a Molecular Psychiatry hasábjain látott napvilágot az ezredfordulón (Hamer és Sirota, 2000). Ebben a példamesében az egyszeri etnogenetikus olyan (pl. amerikai) populációból választott mintát, melyben több etnikum (pl. feketék, fehérek, kínaiak) is reprezentálva volt. Ha a populáció genetikai rétegződését figyelmen kívül hagyjuk, akkor könnyen felfedezhetjük a SUSHI (Successful-Use-of-Selected-Hand-Instruments) génvariánst.
A valóságban azonban nyilvánvaló, hogy kulturális és nem genetikai okokból különbözött az evés módjának fenotípusos megjelenése ebben a populációban. A vizsgált fenotípus hátterében hibásan azonosított SUSHI génvariáns a populáció stratifikáció miatt volt gyakoribb azoknál, akik a többiekhez viszonyítva kiválóan tudtak pálcikával enni.
Az evolúciós szinten relatíve izolált populációk (pl. kaukázusi, orientális, afrikai, stb.) lényegesen különbözhetnek egyes polimorfizmusok allélfrekvenciáiban (E. Wang és mtsai., 2004). Ezért a pszichogenetikai asszociáció vizsgálatok számára az a legmegfelelőbb minta, amely csak egyféle humán szubpopulációt (pl. kaukázusi) foglal magába. A jelen disszertációban bemutatásra kerülő eredmények ebbe a csoportba tartoznak. Eset-kontroll vizsgálatoknál az is elfogadott eljárás, hogy minden szubpopuláció azonos arányban legyen képviselve a kétféle csoportban. Ezért például a nagy mintaszámú, nemzetközi eset-kontroll vizsgálatokban nemcsak beteg, de kontroll mintát is beküld minden résztvevő ország.
A változatos etnikumú személyek pszichogenetikai feltérképezésében ezt a statisztikai alapproblémát tovább árnyalja annak lehetősége, hogy egy adott fenotípus, például a személyiségvonások mérésére kidolgozott önbeszámoló, nem feltétlenül ugyanazt a konstruktumot méri az eltérő szubpopulációkban.
Szelektált mintavételezés
A mintavételi torzítások egy érdekes típusa a szelektált mintavételezés, melynek leggyakoribb példája az, amikor egy nagy mintaszámú, kérdőíves felmérésnél kiválasztanak egy adott dimenziót, és ennek szélső értékeihez tartozó személyek genotípusát határozzák meg. Például Ilyen vizsgálatot végeztek például Ekelund és munkatársai (1999), ahol a Temperamentum és Karakter kérdőívet 4773 személy töltötte ki, de a genetikai vizsgálatba csak 190 személyt vontak be, akik az újdonságkeresés dimenziójának skáláján szélső értékeket értek el.
Eredményeik szerint a magas újdonságkeresési pontszámmal rendelkezők csoportjában nem a 7-es, hanem jóval ritkább 2-es és 5-ös ismétlődésű allélok voltak gyakoribbak.
Ilyen, szelektált mintavételű vizsgálatokat elsősorban a pszichogenetikai kezdeti fázisában végeztek, amikor a genetikai költség még lényegesen nagyobb volt, mint a fenotípus felvétele.
Azonban ezt az eljárást már az első ilyen munkák megjelenésekor is élesen bírálta egyik összefoglalójában például Ebstein, ahol a pszichogenetika ellentmondó eredményeinek forrásait tárgyalta (Ebstein, Zohar, Benjamin, és Belmaker, 2002). Hasonló tanulságot vont le Munafo is egy több mint 30 tanulmányt feldolgozó metaanalízis eredményeit összegezve, mely az újdonságkeresés, az élménykeresés és az impulzivitás dimenziókat tömörítő, úgynevezett megközelítő vonások és a hosszú DRD4 génvariánst kódoló 7-es allél közötti kandidáns génvizsgálatok eredményeit összegzi (Munafo és mtsai., 2008). Szerinte feltételezhető, hogy a szelektált és a nem-szelektált minták genetikai analízisének hatásmérete különbözik és az is valószínűsíthető, hogy az extrém értékek genetikai architektúrája különbözhet a teljes mintában fellelhető kontinuitástól. Mivel mások is hasonló következtetésre jutottak (pl.
Pergadia és mtsai., 2006), kutatási modelljeinkben minden esetben a teljes minta vizsgálatát alkalmaztuk.
2.2.2.3 A genotípus meghatározása
A genotípusokat mérő módszereknek is lehetnek technikai buktatói. Például a 4.1.1, 4.1.3, 4.1.4, 4.2, és 4.2.2 fejezetekben tárgyalt kandidáns gén, a DRD4 VNTR vonatkozásában felmerült, súlyos technikai probléma a 7-es allél szelektív kiesésének lehetősége a mérés során.
Technikai okok miatt ugyanis a hosszú és rövid allélt is tartalmazó mintákban a rövidebb
gyorsabban sokszorosítódik meg, mint a hosszabb. Így ezek a minták tévesen 7-es allélt nem hordozóként jelenhetnek meg, és ez a hiba alapvetően rossz irányba terelheti az asszociáció vizsgálatot. A problémát felismerve azonban kidolgozhatók olyan mérési körülmények, melyek mellett az allél vesztés sokkal kevésbé valószínű (Ronai és mtsai., 2000). A bemutatásra kerülő munkákban a kollaboráló molekuláris genetikai laboratórium az alkalmazott genotipizálási módszereket egyenként validálta két, független módszer használatával. Ezen felül minden elemzett genotípus adathalmaz esetében teszteltük a Hardy–
Weinberg egyensúlyt, melyet a módszerek részletes leírásánál a 3.1.1 fejezetben mutatok be).
A nagyobb volumenű DNS chip vizsgálatokban további paramétereket is szokás megadni a genetikai módszer minőségére vonatkozóan. Ilyen például a „call rate” mérőszáma, mely jelzi, hogy a vizsgálati személyek hány százalékánál sikerült a genotípus meghatározása egy adott polimorfizmusra. A sok polimorfizmust szimultán vizsgáló „DNS chip” esetében ez az érték jellemzően nem éri el a 100%-ot, azaz a polimorfizmusok vizsgálata egyes személyeknél technikai okok miatt sikertelen. Kezdeti vizsgálatainkban azért nincsen megadva ez az érték, mert a genetikai méréseket többször megismételtük részben a megbízhatóság ellenőrzése céljából, részben pedig azért, hogy minden résztvevő genotípusát meghatározzuk. A chip technológia bevezetésével azonban az ismételt mérések anyagi és technikai okok miatt nehézkesek. Ezért a genetikai vizsgálatot úgy tervezik, hogy a minta egy részét (általában 10
%-ot) duplán tesznek fel a DNS chipre, és ezzel ellenőrzik a reprodukálhatóságot. Összegezve a genotípus meghatározása távolról sem abszolút egyértelmű és tévedés mentes, ezért a genotipizáló módszerek minőségellenőrzésére nagy gondot kell fordítani.
2.2.2.4 A „Hiányzó örökletesség” problémaköre
Jelenleg azt gondoljuk, hogy egy adott tulajdonság vagy betegség valamennyi genetikai tényezőjét akkor ismerjük, ha e génhatások összege megegyezik az ikervizsgálatokkal kapott örökölhetőség mértékével. Ezt az azonosságot azonban eddig egyedül a testmagasság vizsgálata esetében sikerült megközelíteni. A testmagasság örökölhetősége mintegy 80%, tehát a környezeti tényezők csupán 20%-ban befolyásolják e fizikai jellemző egyéni variabilitását.
A 2.2.1 fejezetben említett GIANT projekt 2014-ben közzétett eredményei szerint ezidáig a fenotípusos összvariancia mintegy 20%-60%-ának hátterében azonosítottak genetikai (Wood és mtsai., 2014).
A pszichológiai jellemzők és pszichiátriai zavarok esetében az eddig megismert, összes rizikófaktor együttes hatása jelenleg sokkal kisebb, mint az adott jelleg vagy rendellenesség
ikervizsgálatokkal meghatározott örökletessége. Ezt nevezik a „Hiányzó örökletesség”
(„Missing heritability”) problémájának, mely először 2008-ban robbant be a köztudatba (Maher, 2008). Mi lehet ennek az oka? A probléma jelentőségét alátámasztja, hogy az elmúlt nyolc évben majdnem nyolcvan olyan közlemény jelent meg címében ezzel a fogalommal, melyet a PubMed referált. A legfrissebb közleményekből néhány érdekes és nagyon is valószínű magyarázatot kiválogatva elsősorban statisztikai (G.-B. Chen, 2016), illetve epigenetikai (Trerotola, Relli, Simeone, és Alberti, 2015) okokat találunk. Szintén nagyon meggyőző a gén–környezet interakciót, mint a legfontosabb „hiányzó” mozaikdarabot hangsúlyozó elképzelés. Nem elhanyagolható az sem, hogy a vizsgálati résztvevők korától is függhet az egyes genetikai hatások relevanciája (Reynolds és Finkel, 2015).
Az elemzésbe bevont endofenotípusoknak is hihetetlenül nagy jelentősége van. Kézenfekvő, hogy a testmagasság genetikai faktorait azért sikerült ilyen jól feltérképezni, mert a mért fenotípus egyértelműen definiált és egyszerűen mérhető kvantitatív paraméter, így a vizsgálati személyek köre igen nagy lehet. Általánosan is kimondhatjuk, hogy a komplex öröklődésű jellegek genetikai hátterének teljesebb megértését –többek között– az eddig vizsgált fenotípusoknál jobban definiálható, kvantitatív és hatékonyan mérhető endofenotípusok kidolgozásában látják.