PREVENCIÓJÁBAN
1. Bevezetés 1 Az öregedő agy
Az öregedő agy egyes struktúráiban a szinapszisok száma csökken, vagy alakválto-zást szenvednek [Luiten et al., 2013] . A a frontális és temporális régiókban még ép intellektus mellett is fokozódik a kéreg alatti központokból kiinduló mielinhüvely nélküli neuronrendszerek sérülékenysége [Grady and Craik, 2000, Baquer et al., 2009]. A kor előrehaladtával csökken az agy tömege, az idegsejtek atrófiája és pusz-tulása figyelhető meg az agy különböző területeiben különösen, ha neurodegeneratív folyamatok is fennállnak [Tang, 1997; Simic, 1997; Nairn, 1989].
1.2 A kolinerg neurotranszmisszió
A kolinerg neurotranszmisszió a központi idegrendszer mellett a harántcsíkolt izomzatban, valamint az autonóm és paraszimpatikus idegrendszerben is fon-tos szerepet játszik. A transzmisszió kulcsmolekulája az acetilkolin, amely a kolinerg szinapszisokban keletkezik kolinból és acetil-KoA-ból [Vizi, 1997]. A folyamatot a kolin-acetiltranszferáz (ChAT) enzim katalizálja. A kolinerg neu-ronok öregedése során megváltozik az acetilkolin receptorok expressziója, így mivel a kolinerg pályák nagy szerepet játszanak a kognitív funkciókban, dege-nerációjuk memória- és tanulási képességek csökkenéséhez vezet [Lippa, 1980].
Neurodegeneratív betegségek esetében csökken a kolin szinapszisokból történő kiáramlása, valamint visszavétele [Picciotto és Zoli, 2002].
A fentiek alapján azt feltéteztük, hogy a kolinerg pályákban az életkor előrehaladtával csökken az acetilkolin szint, ezért egyik célunk az volt, hogy az idős patkányok hippokampális kolinerg pályáiban a feltehetően csökkenő kolinerg aktivitást mozgástréninggel befolyásoljuk.
2. módszerek
Kísérleteinkben életkoronként 8-10 db 12-32 hónapos Wistar patkányt használtuk, amely állatok kora összehasonlítható az idős emberi életkorokkal is. A 30 hónapos állatok emberi életkorra viszonyítva körülbelül 90 évesek. Az állatokat szobahőmér-sékleten (22±1 °C) tartottuk 12-12 órás világos/sötét megvilágítási periódus alatt. A táplálékhoz és vízhez ad libitum hozzáférésük volt. A 14-32 hónapos állatokat ran-dom módon 6 kísérleti csoportra osztottuk a következő módon (1. ábra):
Három inaktív kontroll csoport (12, 24 és 32 hónapos patkányok): a csoportok állatai nem vettek részt a mozgástréningben. Három aktív csoport (12, 24 és 32 hó-napos patkányok): a csoportok állatai heti 3 alkalommal, 12 méter/perc sebességgel gyalogoltak futópadon. A futópad sebessége egy enyhe, mérsékelt fokozatú testmoz-gásnak felel meg, igazodva ezzel az állatok életkorához.
1. ábra: A mozgástréningben részt vett állatok csoportjai kezelési idejének és életkorának szemléltetése. – Forrás: saját archívum
2.1 Magatartás tesztek
Vizsgálataink során tanulmányoztuk a térbeli mozgás és gyaloglás képességét új környezetben (nyílt porond teszt, angol rövidítéssel OF-Open Field), és a figyelmet (új tárgy felismerése teszt, angol rövidítéssel NOR-Novel Object Recognition).
A nyílt porond teszt vizsgálatban az állatok exploratív viselkedését, aktivitását, és az új környezethez való hozzászokását vizsgáltuk [Walsh és Cummins, 1976].
A teszthez egy kör alapú, 80 cm átmérőjű fából készült arénát (nyílt porond) hasz-náltunk, amit egy 35 cm magas fémhenger vett körül. Az aréna 20 szektorból állt, amelyek két kört (belső és külső) alkottak, amit felülről középen egy 40 W-os izzóval világítottunk meg. Az állatokat az aréna közepére helyeztük és 5 percig figyeltük a viselkedésüket a következő paraméterek figyelembe vételével:
1. pontoztuk az ágaskodásokat (mindkét mellső lábat felemelve), ezek gyakorisá-gát és idejét a fal mentén és az aréna belső részében, valamint
2. a szektorok határvonalain történő áthaladások (határvonal keresztezések) szá-mát a külső (fal melletti) és belső szektorokat elkülönítve.
Az új tárgy felismerése teszt (NOR) a figyelmi funkcióra épülő tárgy-felismerést vizsgálja ismert környezetben, nyílt porondon [Nyakas et al., 2009]. A teszthez 80 cm átmérőjű, 35 cm magasságú ’open field’ arénát használtunk (2. ábra). Az első társítás során két azonos tárgyat helyeztünk a tesztdoboz arénájába a faltól egyforma távolságra, a kör közepéhez képest aszimmetrikusan. Ezután az állatokat egyenként az aréna közepére helyeztük. A tárgyakat a patkányok 5 percig szabadon vizsgálhat-ták az első társítás során, majd 120 perc elteltével került sor a második teszt fázisára, amely során két azonos tárgy közül az egyiket különbözőre cseréltük, amely anya-gában, formájában, színében és felületi simaságban is különbözött a régi tárgytól.
Az arénába behelyezett tárgyakat az állatoknak mindkét tesztfázisban ugyanabban a pozícióban helyeztük el. A második társítás szintén 5 percig tartott. Azokat az egye-deket, amelyek legalább ötször nem látogatták az egyes tárgyakat az első 5 perces időszakaszban, kizártuk a vizsgálatból (a 32 hónapos állatok olyan nagy számban es-tek így ki a vizsgálatból, hogy ez a kor kimaradt a NOR teszt értékelésénél). A tárgy
vizsgálataként értékeltük, ha az állat szagolgatta a tárgyat, amit a felső ajak tapintó szőreinek mozgása kísért, vagy hozzáérintette az orrát a tárgyhoz; illetve ha a mellső lábaival érintette a tárgyat. A tárgyra ülést nem tekintettük a tárgy vizsgálatának.
A második társítás alatt az új tárgy iránti preferenciát mértük másodpercekben az összes, mindkét tárgyra irányuló vizsgálati időnek %-ában. Ha az állat nem ismerte fel, hogy az egyik tárgy egy új tárgy, körülbelül azonos (50-50 %) gyakorisággal látogatta mindkettőt (megismert és új) a második teszt során.
2. ábra: Az open field doboz, valamint az új tárgy felismerése teszt (NOR) szemléltetése. – Forrás: saját archívum
2.2 Immunohisztokémai vizsgálatok
A feldolgozás napján az állatokat mély altatásban transzkardiálisan perfundáltuk 4%
paraformaldehid oldattal, 0,1 M foszfát puffer jelenlétében. Az in situ fixált agyakat 2 napig még posztfixáltuk, majd foszfát pufferben tároltuk a szövettani vizsgálatig.
Dehidrálás után az agyakat kriosztát mikrotommal metszettük 20 mikron vastagsá-gú szeleteket nyerve. Az agyszeleteket immuncitokémiai módszerrel festettük a ChAT pozitív rostok felismeréséhez. A primér antitest ChAT ellenes kecske szérum volt (1:350 higítás, Millipore AB144P, Temencula, USA). Biotinilált másodlagos antitest kezeléssel és diamino-benzidin festéssel tettük láthatóvá a ChAT enzimet [Nyakas, 2011]. A ChAT pozitív axonok denzitását értékeltük különböző agyterületekben: a hippokampusz memóriáért felelős régióiban (CA1, DG), valamint a motoros mozgásért, és a szomatoszenszoros rendszer működéséért felelős kortexekben (M1, Somatosensory cortex). A kvantitatív mérés Quantimet programmal történt (Leica, Germany).
3. Eredmények
3.1 Magatartás tesztek eredményei
Az OF tesztek kiértékelése során szignifikáns különbséget (p<0,05) mutattunk
ki a 32 hónapos állatok horizontális aktivitásában (3. ábra). A mozgástréningben részt vett 32 hónapos állatok többet érdeklődtek az új környezet iránt, aktívabban mozogtak az ’open field’ dobozban a passzív, kontroll csoport állataihoz képest.
A kísérletben részt vett további életkorokban a patkányok horizontális aktivitá-sában, valamint a vertikális aktivitásban nem találtunk korfüggő különbséget.
3. ábra: Az OF tesztek eredményei a horizontális (bal oldali ábra) és vertikális aktivitás (jobb oldali ábra) függvényében, a 12, 24 és 32 hónapos
mozgástré-ningben részt vett állatok és a kontroll csoport állatai esetében. *p<0,05 az azonos életkorú kontroll csoporthoz viszonyítva. – Forrás: saját archívum A NOR tesztek kiértékelése során jelentős különbséget (p<0,05) mutattunk ki a mozgástréningben részesülő 12 hónapos állatok, valamint a kontroll csoport ál-latainak az új tárgy tanulmányozásával eltöltött ideje között (4. ábra). A fizikailag aktív csoport állatai több időt fordítottak az új tárgy vizsgálatára, mint a kontroll csoport állatai, tehát jobban emlékeztek a régi tárgyra. A 24 hónapos állatcsoport esetében nem tudtunk különbséget kimutatni, a 32 hónapos állatok pedig nem érték el a teszt küszöb-értékét, így kizártuk őket a vizsgálatból.
4. ábra: A NOR tesztek eredményei a 12 és 24 hónapos a mozgástréningben részt vett állatok és a kontroll csoport állatai esetében. *p<0,05 a kontrollhoz
viszonyítva. – Forrás: saját archívum
Az állatok mortalitását tekintve, szignifikáns különbséget mutattunk ki (p<0,01) a mozgástréningben részt vett állatok és a passzív, mozgástréningben nem részesülő állatcsoport között (5. ábra). A mozgástréningben részt vett patká-nyoknál a mortalitás alacsonyabb volt, mint a kontroll csoport állatai esetében.
Az elhullás követése a 24 és a 32 hónapos időszakaszban történt, tehát az idősebb állatcsoportra vonatkozik (24 hónapos korig elhullás csak elvétve következett be, mivel ezen állatok kora a középkorú populációt reprezentálja).
5. ábra: A mortalitás mértéke a 32 hónapos kor eléréséig a mozgástréning-ben részt vett állatok (M, kékkel) és a kontroll csoport (K, pirossal) állatainak
függvényében. A különbség χ2 teszttel szignifikáns, p<0,01. – Forrás: saját archívum
3.2 Immunohisztokémiai vizsgálatok eredményei
Az immunohisztokémiai eredmények kiértékelésekor szignifikáns különbséget talál-tunk a hippokampusz CA1 és DG régióiban a ChAT pozitív axonok denzitásának ér-tékeiben a 24 és a 32 hónapos állatok esetében a 12 hónapos korhoz, mint kontrollhoz viszonyítva (6. ábra). Az ábrán jól látható, hogy az életkor előrehaladtával csökken a ChAT axonok denzitásának mértéke. A 24 és a 32 hónapos állatok M1 kortexében, valamint a 32 hónapos állatok szomatoszenzoros kortexében szintén szignifikáns különbséget mutattunk ki a ChAT axonok denzitás értékeinek elemzése során (6.
ábra). Az életkor függő változások statisztikai elemzése csak a nem edzett csoportok-ra vonatkozik és a 12 hónapos kor szolgált kontrollként. A mozgástréning azonban ezekre a változásokra nem volt hatással egyik állatcsoport esetében sem, azaz nem volt különbség az edzett és az inaktív (passzív) csoportok között.
6. ábra: A ChAT axonok denzitása a 12, a 24 és 32 hónapos állatok (mozgástré-ningben részt vett és kontroll csoport állatai) hippokampusz régióiban, vala-mint az M1, és a szomatoszenzoros kortexekben (zöld=mozgástréning csoport, piros=kontroll csoport). *p<0,05 és **p<0,01 vs. 12 hónapos nem edzett
kont-roll csoport. – Forrás: saját archívum 4. összefoglalás és következtetések
A mozgástréningben részt vett idős állatoknál (32 hónapos kor) csökkent a mor-talitás, amely feltételezhetően a rendszeres testmozgás következtében kialakult kedvezőbb szomatikus és mentális állapot eredménye.
Összegzésként tehát elmondható, hogy a 32 hónapos állatok horizontális motilitása új környezetben nem volt alacsonyabb, mint a fiatal 12 hónapos állatoké, szemben a nem edzett, inaktív állatokkal, ahol a legidősebbek kevesebbet mozogtak. Ez a megfigyelés is erősíti a legidősebb korcsoport fokozott általános állapotát rendszeres, 6 hónapos, mérsékelt intenzitású mozgástréninget követően.
A kolinerg axonok ChAT immunoreaktivitása csökken az életkorral, ami már 24 hónapos korban is detektálható. A fiatalabb állatok (12 hónapos kor) esetében nőtt a figyelem mértéke testedzés hatására, míg a 24 hónapos korban, bár volt
javulás, de ez kisebb mértékűnek bizonyult. Azt feltételezzük, hogy optimális figyelem idős korú patkányoknál csak fokozottabb hatású tréninggel érhető el. A kognitív funkciók tanulmányozása céljából elvégzett magatartás tesztek alapján megállapítottuk, hogy a rendszeres mozgástréning a figyelemre, a memóriára, valamint a vertikális aktivitásra egyaránt pozitívan hatott. A hippokampusz régióinak és a motoros mozgásért, valamint a szomatoszenzoros rendszer mű-ködésért felelős kortexek ChAT immunoreaktivitására azonban ez a mértékű és terjedelmű mozgás nem volt hatással. Feltételezhetően a fokozottabb, emelt in-tenzitású mozgástréning ezekre a faktorokra is pozitívan hatna, így távlati célja-ink között szerepelnek olyan kísérletek, amelyek megerősíthetik ezt a hipotézist.
Az eddigi magatartástesztek és immunohisztokémiai vizsgálatok eredményeinek tükrében elmondható, hogy egy hatékony és preventív mozgásterápia kidolgozá-sához elengedhetetlen az optimális paraméterek (időtartam, gyakoriság, intenzi-tás) meghatározása és kidolgozása, valamint adaptálása különböző életkorokra, beleértve az idős korokat is, továbbá szükséges a terápia hatásmechanizmusának megismerése biokémiai és molekuláris biológiai módszerek bevonásával.
Irodalomjegyzék
Baquer NZ, Taha A, Kumar P, McLean P, Cowsik SM, Kale RK, Singh R, Sharma D (2009): A metabolic and functional overview of brain aging linked to neurological disorders. Biogerontology, 10:377-413.
Choi DH, Kwon IS, Koo JH, Jang yC, Kang EB, Byun JE, Um HS, Park HS, yeom DC, Cho IH, Cho Jy (2014): The effect of treadmill exercise on inflammatory responses in rat model of streptozotocin-induced experimental dementia of Alzheimer’s type. Journal of Exercise Nutrition & Biochemistry, 18(2):225-33.
Cho J, Shin MK, Kim D, Lee I, Kim S, Kang H (2015): Treadmill Running Reverses Cognitive Declines due to Alzheimer’s Disease. Medical Sciences Sports Exercise.
Kirkwood TB. Gerontology (2008): Healthy old age. Nature. 455(7214):739740.
Grady CL, Craik FI (2000): Changes in memory processing with age. Current Opinion of Neurobiology 10:224-231.
Koo JH, Kwon IS, Kang EB, Lee CK, Lee NH, Kwon MG, Cho IH, Cho Jy (2013):
Neuroprotective effects of treadmill exercise on BDNF and PI3-K/Akt signaling pathway in the cortex of transgenic mice model of Alzheimer’s disease. Journal of Exercise Nutrition & Biochemistry, 17(4):151-60.
Lippa AS, Pelham RW, Beer B, Critchett DJ, Dean RL, Bartus RT (1980): Brain cholinergic dysfunction and memory in aged rats. Neurobiology of Aging 1:13-19.
Lin TW, Shih yH, Chen SJ, Lien CH, Chang Cy, Huang Ty, Chen SH, Jen CJ, Kuo yM (2015): Running exercise delays neurodegeneration in amygdala and hippocampus of Alzheimer’s disease (APP/PS1) transgenic mice. Neurobiology Learning and Memory, 118:189-97.
Luiten P. Nyakas C, Eisel U, van der Zee E (2013): Aging of the Brain. Neuroscience
in the 21th Century, ed. D.W. Pfaff, Springer Science+Business Media, LLC, pp.
2239-2273.
Nairn JG, Bedi KS, Mayhew TM, Campbell LF (1989): On the number of Purkinje cells in the human cerebellum: unbiased estimates obtained by using the „fractionator”.
Journal of Comparative Neurology 290:527-532.
Nyakas C, Felszeghy K, Szabó R, Keijser JN, Luiten PG, Szombathelyi Z, Tihanyi K (2009): Neuroprotective effects of vinpocetine and its major metabolite cis-apovincaminic acid on NMDA-induced neurotoxicity in a rat entorhinal cortex lesion model. CNS Neuroscience & Therapeutics, 15(2):89-99.
Nyakas C, Granic I, Halmy LG, Banerjee P, Luiten PGM (2011): The Basal Forebrain Cholinergic System in Ageing and Dementia. Rescuing Cholinergic Neurons from Neurotoxic Amyloidβ42 with Memantine. Behavioural Brain Research 221(2):594603.
Picciotto MR, Zoli M (2002): Nicotinic receptors in aging and dementia. Journal of Neurobiology 53:641-655.
Schlosser Covell GE, Hoffman-Snyder CR, Wellik KE, Woodruff BK, Geda yE, Caselli RJ, Demaerschalk BM, Wingerchuk DM (2015): Physical activity level and future risk of mild cognitive impairment or dementia: a critically appraised topic. Neurologist. 19(3):89-91.
Simic G, Kostovic I, Winblad B, Bogdanovic N (1997): Volume and number of neurons of the human hippocampal formation in normal aging and Alzheimer’s disease. Journal of Comparative Neurology, 379:482-494.
Tang y, Nyengaard JR, Pakkenberg B, Gundersen HJ (1997): Age-induced white matter changes in the human brain: a stereological investigation. Neurobiology of Aging, 18:609-615.
Vizi E. Szilveszter (1997): Humán farmakológia, Neurotranszmitterek és receptoraik (160. oldal), Medicina, Budapest
Walsh RN, Cummins RA (1976): The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin, 83(3):482-504.
Lektorálta: Prof. Dr. Koller Ákos, tudományos rektorhelyettes, Testnevelési Egyetem