Az alkalmazott módszerek 1. Vizsgált törzsek

Kutatásunk során 2014. február 1-jétől 2014. november 30-ig az Orvosi Mik-robiológiai Intézet Bakteriológiai Diagnosztikai Laboratóriumába beérkező Staphylococcus lugdunensis törzsekkel dolgoztunk. Mintáink a Debreceni Egye-tem Klinikáiról származtak, a törzseket abscessusból, csontszövetből, fülből, hemokultúrából, mellkasból, sebből és vizeletből izolálták. A vizsgálat időszak alatt összesen 21 darab S. lugdunensi-st izoláltunk, mely 19 betegtől származott.

3.2. A baktériumok tenyésztése

A vizsgálat ideje alatt izolált S. lugdunensis törzseket -20ºC-on tároltuk, folyé-kony glicerines BHI tápoldatban. Munkánk megkezdése előtt az összegyűlt 21 S.

lugdunensis törzset egyszer használatos műanyag oltókaccsal véres agarra oltot-tuk ki. A véres agaron történő tenyésztés standard körülmények között, 37ºC-os inkubátorban, 5% CO₂ koncentráció mellett, 24 órán keresztül történt.

3.3 Biokémiai vizsgálatok

A S. lugdunensis faji azonosítását a hagyományos biokémiai vizsgálatokkal kezd-tük. A kataláz teszt során 3%-os hidrogén-peroxidot cseppentettünk egy tárgy-lemezre, majd egy másik tárgylemez szélével belekevertük a baktérium telepet.

Ha pezsgést tapasztalunk, akkor valamely Staphylococcus fajjal állunk szemben és a próba pozitív. Következő vizsgálatunk a sejtfelszínhez kötött endokoaguláz kimutatására szolgáló clumping-faktor teszt volt. A reakciót Prolex^TM Staph Latex Kittel hajtottuk végre. A vizsgálat során nem koagulált plazmát kell cseppenteni a teszt kártyán kijelölt helyre, majd ebbe a cseppbe kell szuszpendálni a baktériu-mot. Ha a baktériumnak van sejtfelszínhez kötött koaguláz enzime a teszt pozitív, a plazmában fibrin kicsapódás figyelhető meg. A szabad koaguláz enzim kimutatá-sára szolgál a csőkoaguláz próba. Irodalmi adatok alapján a S. lugdunensis törzsek nem rendelkeznek ezzel az enzimmel, így a módszerrel lehetőségünk adódhat a S.

lugdunensis faj S. aureus-tól való elkülönítésére. A próba során egy kémcsőbe 1 ml nyúlplazmát pipettázunk, majd ebbe 4-5 baktérium telepet szuszpendálunk. Az eredmény kb. 4 óra elteltével már látható. Amennyiben pozitív a próba eredménye, a kémcsőben a nyúlplazma megalvad, és S. aureus-szal van dolgunk, ha viszont nem történik semmi, a próba negatív, ekkor S. lugdunensis az izolált törzs

3.4. Mátrix által segített lézer deszorpció és ionizáció (MALDI-TOF)

Mintáinkat a hagyományos azonosítási módszerek mellet MALDI-TOF készü-lékkel is megvizsgáltuk. Kísérleteink során a Microflex LT készüléket használ-tuk a MALDI Biotyper 3.0 szoftverrel (1. ábra). A laboratórium a műszert a rutin diagnosztikában használja a baktériumok gyors, faji szintű azonosítására.

1. ábra: MALDI-TOF MS MicroFlex készülék

Forrás: Debreceni Egyetem Bakteriológiai Diagnosztikai Laboratórium A műszerben pulzáló lézersugár bombázza a targeten elhelyezkedő minta pont-jait, így egyszeres töltésű ionok keletkeznek, melyek repülési idejét méri a gép.

Az ionok összeütközését megakadályozza a gépben létrehozott magas vákuum.

A repülési idő függ az ion tömegétől és az ion töltésétől. A felhasználó számára a készülék ezt a tömeg/töltés arányt ábrázolja az intenzitás függvényében. A ka-pott tömegspektrum egy összetett fehérje profil, mely riboszómális fehérjékből áll, ez a baktérium molekuláris „ujjlenyomatának” fogható fel. A készülék az expresszált proteinek tömegspektrumát összehasonlítja az adatbázisában tárolt törzsek referenciasprektrumával. Az adatbázisunkban jelenleg 5627 faj tömeg-spektruma található meg. Az általunk használt szoftver (MALDI Biotyper) az azonosított fajokat rangsorolja egy „log score”(LS) érték alapján. Ez az érték tükrözi az ismeretlen izolátum spektrumainak az egyezését és az intenzitását az adatbázisban lévő spektrumokkal, amely eredményeként a szoftver egy nulla és három közé eső LS értéket generál az eredmények kiértékelésére. Amennyiben a score (találati) érték: 0,000 és 1,699 közé esik, nem lehetséges az identifikálás;

1,700 és 1,999 közé eső értékek esetében a genus szintű identifikálás jó; 2,000 és 2,299 közötti értékeknél biztos genus szintű, lehetséges species szintű az

azono-sítás, 2,3 feletti értéknél pedig magas valószínűségű a species szintű azonosítás.

A mérés lépései:

1. Mintafelvitel: A baktérium körülbelül 1 telepét közvetlenül a 96 helyes mintahordozó (target) egy körére kell felvinni, direkt transzferrel, vékony rétegben.

2. Hagyni kell száradni a felvitt mintát, majd 1 µl mátrix oldatot cseppenteni hozzá. Fontos, hogy a mátrixnak jól ionizálhatónak kell lennie, erre alkal-mas a laboratóriumunkban használt alfa-ciano-4-hidroxi-fahéjsav.

3. A mátrix száradása során az oldószerek elpárolognak hátrahagyva a kikris-tályosodott mátrixot, miközben az analit molekulák beágyazódtak a mátrix kristályok közé.

4. A targetet a készülék target tartó helyére kell betenni.

5. Mérés: A MALDI-TOF MS a mérések eredményét továbbítja egy hozzá csatlakoztatott számítógépre, mely a rátelepített FlexControl nevű program-mal kiértékeli, és közli az eredményeket.

Méréseinket, mivel vizsgálni kívántuk, hogy a minta előkészítés körülményei mennyiben változtatják meg a mérések eredményét, elvégeztük hangyasavas extrakciót alkalmazva. Ez ugyanis a sejtfalat roncsolja, így a riboszómális fehér-jék könnyebben hozzáférhetővé válnak. A mérés során 1µl hangyasavat cseppen-tettünk a target-re felkent telepekre, a mátrix hozzáadása előtt. Minden minta esetében 3 párhuzamos mérést végeztünk.

3.4. Antibiotikum rezisztencia vizsgálat korongdiffúziós módszerrel

Az antibiotikum korongdiffúzió a rutin diagnosztika leggyakrabban használt, nemzetközileg elfogadott módszere. A vizsgálat során Mueller Hinton agar (Oxid) felhasználásával a Kirby-Bauer-féle korongdiffúziós módszert alkalmaz-tuk. A Kirby-Bauer-féle módszer során az elérhető vérszintnek megfelelő an-tibiotikum koncentrációval átitatott szűrőpapír korongokkal vizsgáltuk meg a törzsek antibiotikum érzékenységét, a gyártó által meghatározott leírás alapján.

A kapott gátlási zónák átmérőjét lemértük, és a törzseket érzékeny (é) és rezisz-tens (R) kategóriába soroltuk. Az inkubációs hőmérséklet a hazai gyakorlatnak megfelelően 33-35ºC közé eset, az inkubációs idő pedig 24 óra volt. Az anti-biotikum érzékenységi vizsgálatokat az European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) érvényben lévő nemzetközi ajánlásai alap-ján végeztük és interpretáltuk. A S.lugdunensis izolátumok érzékenységét a következő antibiotikumokra teszteltük: penicillin, cefoxitin, erythromycin, clarithromycin, clindamycin, mupirocin, vancomycin, teicoplanin, rifampicin, moxifloxacin, levofloxacin, trimethropim/sulphamethoxazol, tetracyclin, tigecyclin, gentamicin, tobramycin.