OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2012

1

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2012

1.1. Festékpróbák az anyagtudományban (KM), szept. 25.

1.2. Nem-lineáris lézerspektroszkópia (KT) 1. 3. Fotodinamikus terápia (VT)

1.4. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (KM) 1. 5. Fotokróm anyagok (BP)

ALAPISMERETEK

(vizsgára, doktori szigorlatra átismételni)

Kémiai anyagszerkezettan

V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05)

VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05)

VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05)

X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

3

Festékpróbák

Abszorbeáló próbák Fluoreszkáló próbák

Reichardt’s dye

N Ph Ph

Ph

Ph Ph

O +

_

5

N Ph Ph

Ph

Ph Ph

O +

_ O

Ph Ph

Ph

Ph

N Ph

. .

h

Reichardt’s dye

„charge transfer” festék

C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, 2319-2358 (1994)

A Reichardt-festék abszorpciós színképe 90 %-os (m/m) glicerin-víz elegyben (GW), ionos folyadékban (IL), acetonitrilben (ACN) és diklórmetánban (DCM).

K.A. Fletcher, Green Chem. 3, 210-215 (2001)

7

S

 = 810 nm Ph-O-Ph

 = 453 nm H₂O

S

Oldószer polaritás

skála

Az oldószer polaritását jellemzi.

N

E

   

  ^{víz E}  ^TMS 

E

TMS E

oldószer E E

T T

T N T

T



 

9

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől

Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől

Etanolban + 78 C 

= 568 nm - 78 C 

= 513 nm

Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól Etanolban  1 bar 

= 547 nm

10 kbar 

= 520 nm

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben

1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység

3. Háromszoros szelektivitás

- gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint

Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

11

Fluoreszcens festékpróbák

J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence

Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic,

London, 1999

Vázlat

 Műszerek

stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás

Statikus kioltás

 dinamikus kioltás

 oldószer polaritás / hőmérséklet / viszkozitás hatása

 Lippert-egyenlet

 vibrációs relaxáció

 oldószer relaxáció

 kettős fluoreszcencia

 feherjék fluoreszcenciája / triptofán FRET

rotációs diffúzió (orientációs relaxáció)

13

Spektrofluoriméterek

-stacionárius

- időfelbontásos (

mérése, időkorrelált

egyfoton-számlálás)

Stacionárius

15

Időkorrelált

egyfoton-számlálás

Fluoreszcencia lecsengési görbe

17

Statikus kioltás

Oxazin1 + receptor

19

21

 

  

     

   

    

    

     

  ^Q

I K I

Q F K

F

Q Q

F F Q

F

F K F

Q F

F F

Q F

Q K F

Q F

Q F

F

F

 







 









 







1 1

1

0 0

0 0

0

Dinamikus kioltás

23

Lakowicz, p. 461

Lakowicz, p. 461

25

M + h

M + h

M + 

M + Q

M

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka

Kioltó nélkül

 

 

 

 k M k M

dt M d

nr f

Kioltóval

 

 

   

^{ }

dt M d

q nr

f





 









     

f 0 f

k k

k M

k M

k

M Φ k

 

 _  ^ _

 

   

 

^{ }

^{ }

k

M Φ k

q nr

f

f q

nr f

f



 



 _  _ ^ _

27

    ^Q

k k

1 k k

k

Q k

k k

Φ Φ

nr f

q nr

f

q nr

0 f

 

 



 

  ^Q

k k

1 k I

I

nr f

q F

F 0

 



Stern-Volmer egyenlet

Oldószer polaritása és hőmérséklete

29

S

S

Oldószer polaritás

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet

+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

31

Lippert-egyenlet





2 2 F 3

A

E

1 n

2

1 n

1 2

1 a

h 2

h      



 







 







 







+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása

Lakowicz, p. 191

33

S

S

vibrációs relaxáció

10^-12 s

oldószer relaxáció

oldószer relaxáció

10^-10 s

abszorpció 10^{-15 s}

emisszió 10^{-9 s}

Hőmérséklet hatása:

folyamatok Jablonski-diagramon

Patman

CH3(CH2)14 C

O

CH3

CH2 CH2N(CH3)3+

A Prodan lipofilizált + ionos változata

35

400 500

I_F

 [nm]

Lakowicz, p. 199

-Oldószer relaxáció sebessége kisebb, ha csökken a hőm.

- a sáv -30C-on a legszélesebb: kettős fluoreszc.

Kettős fluoreszcencia

DMANCN fl. Színképe etilénglikolban Lakowicz, p. 201

37

CH2 CH NH2

COOH

*

*

COOH NH2 CH2 CH

HO

*

COOH NH2 CH2 CH

NH

Fluoreszkáló aminosavak

fenil-alanin

tirozin

triptofán

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma

(víz, pH 7) Lakowicz, p. 446

39

Lakowicz p. 453

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára

1) Apoazurin Pfl 2) T1 ribonuklease 3) staphillococcus

nuclease 4) glucagon

Rezonancia energia-átadás

(Förster resonance energy transfer = FRET)

Távolságmérés fluoreszcenciával!

Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el

FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

41

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál

A hatás 1/r

-nal arányos

43

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata

C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

Akceptor

Donor: EtBr

(etidium bromid)

N

C₂H₅

NH₂ H₂N

+

Br-

45

EtBr abszorpció

BODIPY

fluoreszcencia

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni

47

Festékmolekula orientációs relaxációja

de hd

or

τ τ

τ  

+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

Hidrodinamikai súrlódás járuléka

0 M

hd

τ

kT fC ηV

τ  

Stokes-Einstein-Debye egyenlet

49

Dielektromos súrlódás járuléka

 

3 2

de

τ

1 2ε

1 ε

kT τ a





 

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001)

Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer

Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

51

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán



[cm

]



[cm

]



- 

[cm

]



[ps]



[ps]

víz 15 699 14 970 729 380 110

gyanta 15 211 14 925 286 2340 >10 000