OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2019

(1)

1

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2019

1.Fluoreszcens jelzőanyagok (KM), szept.18.

2.Királis anyagok optikai spektroszkópiája (KM), szept. 25.

3.Fotokróm anyagok (BP), okt. 2.

4. Fémkomplexek lumineszcenciája (BP), okt. 9.

5. Fotodinámiás terápia (VT), okt. 16.

6. Fluoreszcenciás képalkotó eljárások (VT), okt. 30.

(2)

2

ALAPISMERETEK

(vizsgára, doktori szigorlatra átismételni)

Kémiai anyagszerkezettan

V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05)

VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05)

VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05)

X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

(3)

3

Nobel prize in Chemistry 2008

Martin Chalfie

Osamu Simamura

Roger Y. Tsien

GFP = Green

Fluorescent Protein

(4)

4

Nobel prize in Chemistry 2014

Eric

Betzig Stefan W.

Hell

William E.

Moerner

STED = Stimulated Emission Depletion

(5)

Jablonski-diagram

V R

S ₀ S ₁

T ₁ T ₂ S ₂

s z i n g u l e t t a b s z o r b c i ó

I S C

I C

f lu o r e s z c e n c i a

t r ip l e t t a b s z o r b c i ó

f o s z f o r e s z c e n c i a I C

V R : I S C : I C : S : T :

r e z g é s i r e l a x á c i ó

S p i n v á l t ó á t m e n e t ( I n t e r S y s t e m C r o s s i n g ) b e l s ő k o n v e r z i ó ( I n t e r n a l C o n v e r s i o n )

s z i n g u l e t t t r ip l e t t

v = 0 v = n

s u g á r z á s n é l k ü l i á t m e n e t s u g á r z á s o s á t m e n e t

(6)

6

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben

1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység

3. Háromszoros szelektivitás

- gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint

Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

(7)

7

Fluoreszcens festékpróbák

Cél: a mikrokörnyezet jellemzése a fluoreszcencia sáv

J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence

Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic,

London, 1999

(8)

Vázlat

8

 Módszerek és műszerek

stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás

 Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása

 Polaritás szenzorok

 Viszkozitás szenzorok

 Fehérjék fluoreszcenciája / triptofán

Távolságmérés: FRET

(9)

9

Spektrofluoriméterek

-stacionárius

- időfelbontásos (

_F

mérése, időkorrelált

egyfoton-számlálás)

(10)

10

Stacionárius

(11)

11

Gerjesztési és emissziós spektrum

Gerjesztési sp: hasonlít az abszorpciósra, S₀ →S₁, S₀ →S₂, ∙∙∙

átmenetek sávjai

Emissziós sp: csak S₁ →S₀,

I_F készülékfüggő!



^nm





exc

em

λ

λ 



âÎ^.û^F^.



(12)

12

Fluoreszcencia kvantumhatásfok

száma fotonok

elnyelt

száma fotonok

t kisugárzot

F 



_F

meghatározása

- integráló gömbbel - standarddal

2 2 R X X

R R

R X

X

n

n A

A I

 I





I

_X

,I

_R

a fluoreszcenciasávok integrált intenzitása A

_X

, A

_R

abszorbanciák a gerjesztés hullámhosszán n

_X

, n

_R

törésmutatók

X: minta

R: standard

(13)

13

Időkorrelált

egyfoton-számlálás

(14)

14

Fluoreszcencia lecsengési görbe

IRF

  _



 







F F

A t t

I ^exp 

(15)

15

Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása

(16)

16

CoroNa Green

Na

⁺

indikátor

(17)

17

Na

⁺

indikátor

Na

⁺

ionok eloszlása idegsejtben,

mikroszkópos kép CoroNa Green alkalmazásával,

W. J. Tyler et al. , PlosOne 3, e3511 (2008)

(18)

18

Klorid indikátor

MQAE

Működése dinamikus kioltáson alapszik

Szelektív: nitrát, foszfát nem oltják ki, Br

^-

, I

^-

igen

(19)

19

Klorid indikátor

Kloridion eloszlás idegsejtekben

IF kép FLIM: fluorescence

lifetime imaging

(20)

20

M + h

M + 

M + Q M

^*

Dinamikus kioltás: Stern-Volmer egyenlet

(21)

21

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka

Kioltó nélkül

 

^ ^

 

^ ^

 

^

 k M k M

dt M d

nr f

Kioltóval

 

^k

 

^M ^k

   

^M ^k ^M

^{ }

^Q

dt M d

q nr

f



 







     

f nr f nr

f 0 f

k k

k M

k

M Φ k

 

 _  ^ _

 

^M ^k

   

^M

 

^k ^M

^{ }

^Q ^k ^k ^k ^k

^{ }

^Q

k

M Φ k

q nr

f

f q

nr f

f



 



 _  _ ^ _

(22)

22

    ^Q

k k

1 k k

k

Q k

k k

Φ Φ

nr f

q nr

f

q nr

0 f

 

 



 

  ^Q

k k

1 k I

I

nr f

q F

F 0

 



Stern-Volmer egyenlet

(23)

23

Polaritás szenzorok

nílus vörös

water, - methanol - ethanol - acetonitrile - dimethylformamide, 6.

acetone - ethyl acetate - dichloromethane - n-hexane - methyl-tert- butylether - cyclohexane - toluene

.

(24)

24

Szolvatoktromizmus: a szín függ az oldószertől

(25)

25

Kim G H et al. J Cell Sci 2001;114:2009-2014

Algasejtből nyert lipid testecskék rendeződése

A minta nílus vörössel festve: a membrán (lipid) sárga

A sejtmembrán sérülése után új sejtek képződnek

(26)

26

S

₀

S

₁

Oldószer polaritás

„charge transfer (CT)” festékek

(27)

27

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet

+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

(28)

28

Lippert-egyenlet



_E _G



² _VR

2 2 F 3

A

E

1 n

2 1 n

1 2

1 a

h 2

h      



 







 







 







+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

(29)

29

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása

Lakowicz, p. 191

etanol-víz

oldószerelegy

(30)

Viszkozitás szenzor

30

(31)

31

Festékmolekula orientációs relaxációja (rotációs diffuzió)

M 0

or

τ

kT fC ηV

τ  

Stokes-Einstein-Debye egyenlet

f alaktényező (gömbalakra f = 1)

C súrlódási tényező (0<C<1, ha a részecske nagy az oldószermolekulákhoz képest C ~ 1)

 környezet viszkozitása V_M molekula térfogat T hőmérséklet

k Boltzmann állandó

(32)

32

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001)

Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer

Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

(33)

33



_or

mérése:

a fluoreszcencia depolarizáció időfüggését mérjük

(34)

34

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán



_A

[cm

^-1

]



_F

[cm

^-1

]



_A

- 

_F

[cm

^-1

]



_S1

[ps]



_or

[ps]

víz 15 699 14 970 729 380 110

gyanta 15 211 14 925 286 2340 >10 000

(35)

35

Kettős fluoreszcencia:

twisted intramoleculat charge transfer = TICT

DMANCN fl. színképe etilénglikolban, a két sáv int. aránya viszkozitásfüggő

Lakowicz, p. 201

(36)

36

CH2 CH NH2

COOH

*

COOH NH2 CH2 CH

HO

*

COOH NH2 CH2 CH

NH

Fluoreszkáló aminosavak

fenil-alanin

tirozin

triptofán

(37)

37

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma

(víz, pH 7) Lakowicz, p. 446

(38)

38

Lakowicz p. 453

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára

1) Apoazurin Pfl 2) T1 ribonuclease 3) staphillococcus

nuclease 4) glucagon

(39)

39

Lakowicz, p. 461

(40)

40

Lakowicz, p. 461

(41)

41

Rezonancia energia-átadás

(Förster resonance energy transfer = FRET)

Távolságmérés fluoreszcenciával!

Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el

FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

(42)

42

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

(43)

43

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál

A hatás 1/r

⁶

-nal arányos

(44)

44

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata

C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

(45)

45

Akceptor

Donor: EtBr

(etidium bromid)

N

C₂H₅

NH₂ H₂N

+

Br-

(46)

46

EtBr abszorpció

BODIPY

fluoreszcencia

(47)

47

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni