OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2016
1.Fluoreszcens jelzőanyagok (KM), szept.21.
2.Fotokróm anyagok (BP), szept. 28.
3. Fémkomplexek lumineszcenciája (BP), okt. 5.
4. Fotodinámiás terápia (VT), okt. 12.
5. Fluoreszcenciás képalkotó eljárások (VT), okt. 19.
6. Közeli infravörös spektroszkópia és mikroszkópia (GSz), okt. 26.
7. Királis anyagok optikai spektroszkópiája (KM), nov. 2.
ALAPISMERETEK
(vizsgára, doktori szigorlatra átismételni)
Kémiai anyagszerkezettan
V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05)
VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05)
VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05)
X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)
Jablonski-diagram
V R
V R
S 0 S 1
T 1 T 2 S 2
s z i n g u l e t t a b s z o r b c i ó
I S C
I C
f lu o r e s z c e n c i a
t r ip l e t t a b s z o r b c i ó
f o s z f o r e s z c e n c i a I C
V R : I S C : I C : S : T :
r e z g é s i r e l a x á c i ó
S p i n v á l t ó á t m e n e t ( I n t e r S y s t e m C r o s s i n g ) b e l s ő k o n v e r z i ó ( I n t e r n a l C o n v e r s i o n )
s z i n g u l e t t t r ip l e t t
v = 0 v = n
s u g á r z á s n é l k ü l i á t m e n e t s u g á r z á s o s á t m e n e t
A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben
1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység
3. Háromszoros szelektivitás
- gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint
Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál
Fluoreszcens festékpróbák
Cél: a mikrokörnyezet jellemzése a fluoreszcencia sáv
J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999
Vázlat
Műszerek
stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás
Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása
Polaritás szenzorok
Viszkozitás szenzorok
Fehérjék fluoreszcenciája / triptofán
Távolságmérés: FRET
Spektrofluoriméterek
-stacionárius
- időfelbontásos (F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás)
Stacionárius
9
Gerjesztési és emissziós spektrum
Gerjesztési sp: hasonlít az abszorpciósra, S0 →S1, S0 →S2, ∙∙∙
átmenetek sávjai
Emissziós sp: csak S1 →S0,
I készülékfüggő!
nm
exc
em λ
λ
aI.uF.
10
Fluoreszcencia kvantumhatásfok
száma fotonok
elnyelt
száma fotonok
t kisugárzot
F
F meghatározása
- integráló gömbbel - standarddal
2 2 R X X
R R
R X
X n
n A
A I
I
IX,IR a fluoreszcenciasávok integrált intenzitása AX, AR abszorbanciák a gerjesztés hullámhosszán nX, nR törésmutatók
X: minta R: standard
Időkorrelált
egyfoton-számlálás
Fluoreszcencia lecsengési görbe
IRF
F F
A t t
I exp
Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása
CoroNa Green Na+ indikátor
Na+ indikátor
Na+ ionok eloszlása idegsejtben,
mikroszkópos kép CoroNa Green alkalmazásával,
W. J. Tyler et al. , PlosOne 3, e3511 (2008)
SBFI Na+ indikátor
Gerjesztési spektrumot mérnek, ott max eltolódik Szelektív: a Na+ a K+ mellett is mérhető
SBFI = sodium-binding benzofuran isophthalate
Na+ indikátor
SBFI-vel festett idegsejt
Klorid indikátor
MQAE
Működése dinamikus kioltáson alapszik
Szelektív: nitrát, foszfát nem oltják ki, Br-, I- igen
Klorid indikátor
Kloridion eloszlás idegsejtekben
IF kép FLIM: fluorescence
lifetime imaging
M + h
M + h
M +
M + Q M*
Dinamikus kioltás: Stern-Volmer egyenlet
A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka
Kioltó nélkül
k M k M
dt M d
nr f
Kioltóval
k
M k
M k M
Qdt M d
q nr
f
f nr f nrf 0 f
k k
k M
k M
k
M Φ k
M k
M
k M
Q k k k k
Qk
M Φ k
q nr
f
f q
nr f
f
Qk k
1 k k
k
Q k
k k
Φ Φ
nr f
q nr
f
q nr
0 f
Qk k
1 k I
I
nr f
q F
F 0
Stern-Volmer egyenlet
Polaritás szenzorok
nílus vörös
water, - methanol - ethanol - acetonitrile - dimethylformamide, 6.
acetone - ethyl acetate - dichloromethane - n-hexane - methyl-tert- butylether - cyclohexane - toluene.
Szolvatoktromizmus: a szín függ az oldószertől
Kim G H et al. J Cell Sci 2001;114:2009-2014
Algasejtből nyert lipid testecskék rendeződése
A minta nílus vörössel festve: a membrán (lipid) sárga
A sejtmembrán sérülése után új sejtek képződnek
S0 S1
Oldószer polaritás
„charge transfer (CT)” festékek
Polaritás hatása: Lippert-egyenlet
+
_
- - - -
+ + + +
2a
G v. E
Lippert-egyenlet
E G
2 VR2 2 F 3
A
E
1 n
2
1 n
1 2
1 a
h 2
h
+
_
- - - -
+ + + +
2a
G v. E
29
Naftilamin-származékok Stokes eltolódása
Lakowicz, p. 191
etanol-víz
oldószerelegy
Viszkozitás szenzor
Festékmolekula orientációs relaxációja (rotációs diffuzió)
M 0
or τ
kT fC ηV
τ
Stokes-Einstein-Debye egyenlet
f alaktényező (gömbalakra f = 1)
C súrlódási tényező (0<C<1, ha a részecske nagy az oldószermolekulákhoz képest C ~ 1)
környezet viszkozitása VM molekula térfogat T hőmérséklet
k Boltzmann állandó
Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán
Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001)
Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer
Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát
ormérése:
a fluoreszcencia depolarizáció időfüggését mérjük
Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán
A [cm-1]
F [cm-1]
A- F [cm-1]
S1 [ps]
or [ps]
víz 15 699 14 970 729 380 110
gyanta 15 211 14 925 286 2340 >10 000
35
Kettős fluoreszcencia:
twisted intramoleculat charge transfer = TICT
DMANCN fl. színképe etilénglikolban, a két sáv int. aránya viszkozitásfüggő
Lakowicz, p. 201
CH2 CH NH2
COOH
*
*
COOH NH2 CH2 CH
HO
*
COOH NH2 CH2 CH
NH
Fluoreszkáló aminosavak
fenil-alanin
tirozin
triptofán
Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma
(víz, pH 7) Lakowicz, p. 446
38
Lakowicz p. 453
A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára
1) Apoazurin Pfl 2) T1 ribonuclease 3) staphillococcus
nuclease 4) glucagon
Lakowicz, p. 461
Lakowicz, p. 461
Rezonancia energia-átadás
(Förster resonance energy transfer = FRET)
Távolságmérés fluoreszcenciával!
Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el
FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők
Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.
Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál
A hatás 1/r6-nal arányos
Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata
C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)
Akceptor
Donor: EtBr
(etidium bromid)
N
C2H5
NH2 H2N
+
Br-
EtBr abszorpció
BODIPY
fluoreszcencia
Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni