OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2015

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2015

1.Fluoreszcens jelzőanyagok (KM), szept.16.

2.Fotokróm anyagok (BP), szept. 23.

3. Fémkomplexek lumineszcenciája (BP), szept. 30.

4. Fotodinámiás terápia (VT), okt. 7.

5. Fluoreszcenciás képalkotó eljárások (VT), okt. 14.

7. Közeli infravörös spektroszkópia és mikroszkópia (GSz), okt. 21.

8. Királis anyagok optikai spektroszkópiája (KM), okt. 28.

ALAPISMERETEK

(vizsgára, doktori szigorlatra átismételni)

Kémiai anyagszerkezettan

V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05)

VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05)

VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05)

X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

Jablonski-diagram

V R

V R

S ₀ S ₁

T ₁ T ₂ S ₂

s z i n g u l e t t a b s z o r b c i ó

I S C

I C

f lu o r e s z c e n c i a

t r ip l e t t a b s z o r b c i ó

f o s z f o r e s z c e n c i a I C

V R : I S C : I C :

r e z g é s i r e l a x á c i ó

S p i n v á l t ó á t m e n e t ( I n t e r S y s t e m C r o s s i n g ) b e l s ő k o n v e r z i ó ( I n t e r n a l C o n v e r s i o n )

v = 0 v = n

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben

1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység

3. Háromszoros szelektivitás

- gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint

Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

Fluoreszcens festékpróbák

Cél: a mikrokörnyezet jellemzése a fluoreszcencia sáv

J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence

Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic,

London, 1999

Vázlat

 Műszerek

stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás

Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása

 Polaritás szenzorok

 Viszkozitás szenzorok

 Fehérjék fluoreszcenciája / triptofán

Távolságmérés: FRET

Spektrofluoriméterek

-stacionárius

- időfelbontásos (

mérése, időkorrelált

egyfoton-számlálás)

Stacionárius

Gerjesztési és emissziós spektrum

Gerjesztési sp: hasonlít az abszorpciósra, S₀ →S₁, S₀ →S₂, ∙∙∙

átmenetek sávjai



Időkorrelált

egyfoton-számlálás

Fluoreszcencia lecsengési görbe

Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása

CoroNa Green

Na

indikátor

Na

indikátor

Na

ionok eloszlása idegsejtben,

mikroszkópos kép CoroNa Green alkalmazásával,

W. J. Tyler et al. , PlosOne 3, e3511 (2008)

SBFI Na

indikátor

Gerjesztési spektrumot mérnek, ott  eltolódik

Na

indikátor

SBFI-vel festett idegsejt

Klorid indikátor

MQAE

Szelektív: nitrát, foszfát nem oltják ki, Br

, I

igen

Klorid indikátor

Kloridion eloszlás idegsejtekben

IF kép FLIM: fluorescence

lifetime imaging

M + h

M + h

M + 

M + Q M

Dinamikus kioltás: Stern-Volmer egyenlet

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka

Kioltó nélkül

 

 

 

 k M k M

dt M d

nr f

Kioltóval

 

 

   

^{ }

dt M d

q nr

f





 









     

f 0 f

k k

k M

k M

k

M Φ k

 

 _  ^ _

 

   

 

^{ }

^{ }

k

M Φ k

q nr

f

f q

nr f

f



 



 _  _ ^ _

    ^Q

k k

1 k k

k

Q k

k k

Φ Φ

nr f

q nr

f

q nr

0 f

 

 



 

  ^Q

k k

1 k I

I

nr f

q F

F 0

 



Stern-Volmer egyenlet

Polaritás szenzorok

nílus vörös

water, - methanol - ethanol - acetonitrile - dimethylformamide, 6.

acetone - ethyl acetate - dichloromethane - n-hexane - methyl-tert- butylether - cyclohexane - toluene

.

Kim G H et al. J Cell Sci 2001;114:2009-2014

Algasejtből nyert lipid testecskék rendeződése

A minta nílus vörössel festve: a membrán (lipid) sárga

A sejtmembrán sérülése után új sejtek képződnek

Nile red staining of neutral and polar lipids in SAM-6-induced apoptosis on tumor cells.

S

S

Oldószer polaritás

„charge transfer (CT)” festékek

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet

+

_

- - - -

+ + + +

_G v. _E

Lippert-egyenlet





2 2 F 3

A

E

1 n

2

1 n

1 2

1 a

h 2

h      



 







 







 







+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása

etanol-víz

oldószerelegy

Viszkozitás szenzor

Festékmolekula orientációs relaxációja (rotációs diffuzió)

M 0

or

τ

kT fC ηV

τ  

Stokes-Einstein-Debye egyenlet

f alaktényező (gömbalakra f = 1)

C súrlódási tényező (0<C<1, ha a részecske nagy az oldószermolekulákhoz képest C ~ 1)

 környezet viszkozitása V_M molekula térfogat

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001)

Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer

Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát



mérése:

a fluoreszcencia depolarizáció időfüggését mérjük

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán



[cm

]



[cm

]



- 

[cm

]



[ps]



[ps]

víz 15 699 14 970 729 380 110

gyanta 15 211 14 925 286 2340 >10 000

Kettős fluoreszcencia:

twisted intramoleculat charge transfer = TICT

CH2 CH NH2

COOH

*

*

COOH NH2 CH2 CH

HO

*

COOH NH2 CH2 CH

NH

Fluoreszkáló aminosavak

fenil-alanin

tirozin

triptofán

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma

38

Lakowicz p. 453

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára

1) Apoazurin Pfl 2) T1 ribonuclease 3) staphillococcus

nuclease 4) glucagon

Lakowicz, p. 461

Rezonancia energia-átadás

(Förster resonance energy transfer = FRET)

Távolságmérés fluoreszcenciával!

Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el

FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál

A hatás 1/r

-nal arányos

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata

C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

Akceptor

Donor: EtBr _N

C₂H₅

NH₂ H₂N

+

EtBr abszorpció

BODIPY

fluoreszcencia

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni