Sporulációs vizsgálatok

A Ph. visci sporulációját néhány speciális, spóraindukció során gyakran alkalmazott táptalajokon (42. ábra) és különböző megvilágítási körülmények (fehér fény, közeli-UV, megvilágítás nélkül és ezek alternációja) mellett vizsgáltuk (43. ábra). A kezelések hatására a varianciaanalízis alapján minden esetben szignifikáns volt, mely nem csak a táptalajok (F6,126= 72.06, p<0.001) és fényhatások (F5,126= 120.82, p<0.001) esetén volt kimutatható, hanem azok interakciója nyomán is szignifikánsan emelkedett a képződött konídiumok mennyisége (F30,125= 34.48, p<0.001).

42. ábra: A különböző táptalajok hatása a Ph. visci konídium mennyiségére (db/cm²).

(BDA: burgonya-dextróz agar, Cel BDA: celofánnal fedett BDA, Csz BDA: cukorszegény BDA, ZA: zabkivonat agar, SA: S agar, SNA: SN agar, V8A: ¼ BDA+ V8-zöldséglé agar.)

99 A táptalajok tekintetében a Tukey-Kramer-féle próba alapján a Ph. visci sporulációjának előidézésére leginkább a zabkivonat agar volt alkalmas, mivel a képződött spórák mennyisége ezen a táptalajon az összes többi vizsgált táptalajhoz képest szignifikánsan nagyobb volt (p<0.001). A Ph. visci hasonlóan jól sporulált továbbá burgonya-dextróz, cukorszegény dextróz és V8-zöldséglé agaron is. Míg a cukorszegény és hagyományos burgonya-dextróz táptalajok között a képződött konídiumok mennyisége tekintetében nem volt szignifikáns különbség (p=0.99), addig a V8-zöldséglé agaron mért spóraszám mindkét táptalajnál szignifikánsan nagyobb volt (p<0.001), utóbbin csak 5%-os szignifikancia szint mellett (p=0.029). A többi táptalajon a sporuláció már jóval kevésbé volt intenzív (celofánnal fedett BDA, SA és SNA), az itt mért spóraszámok között szignifikáns különbséget nem találtunk (43. ábra).

43. ábra: A különböző megvilágítások hatása a Ph. visci képződő konídium mennyiségére (db/cm²).

A Ph. visci sporulácóját nemcsak a különböző táptalajok, de az eltérő fényhatások is igen jelentősen befolyásolták. A legnagyobb spóraszámot 12h közeli-UV/ 12 h fehér fény alternáló megvilágítása esetén mértünk, mely az összes további kezeléshez képest szignifikánsan is nagyobb volt (p<0.001). Viszonylag magas spóraszámot eredményezett a folyamatos (24 h) fehér fénnyel történő megvilágítás is, mely 12h közeli-UV/ 12 h fehér fény alternáló megvilágításánál szignifikánsan kisebb, míg a többi kezeléshez képest szignifikánsan nagyobb konídium mennyiséget eredményezett (p<0.001). Míg a fent említett kezelések elősegítették, addig a többi kezelés inkább gátolta a Ph. visci sporulácóját.

100 A kórokozó izolátumai legkevésbé megvilágítás nélkül (24 h sötét) sporuláltak, ehhez képest azonban sem a fehér fény 12 h-a alternációja (12 h fény/ 12 h sötét), sem a folyamatos (24 h) közeli-UV alkalmazása sem eredményezett szignifikánsan (p<0.001) magasabb spóraszámot (43. ábra).

A vizsgált táptalajok és fényhatások interakciója a Tukey-Kramer-féle próbával is kimutatható volt, vagyis a fényhatások és táptalaj kölcsönhatása is jelentősen befolyásolta a Ph. visci sporulációját (44. ábra és 13. táblázat). A táptalajok és fényhatások interakciója nyomán a szignifikánsan legmagasabb (p<0.001) konídium mennyiség zabkivonat agaron 12h fehér fény/ 12h közeli-UV hatására keletkezett, átlagosan egy 90 mm-es Petri-csészében 7,8

×10⁵ db konídium képződött. Ez a kezelés viszonylag magas spóraszámot (2–3×10⁵ db/Petri-csésze) eredményezett burgonya-kivonat és V8-zöldséglé agaron, azonban a többi táptalajon a spóraindukáló hatása elhanyagolható volt.

44. ábra: A különböző megvilágítások és táptalajok interakciója nyomán megfigyelt spóraszám (db konídium/cm²) átlagai (±SEM).

A burgonya-dextróz és cukormentes burgonyadextróz agarok esetében a 24 órás fehér fénnyel való megvilágítás szignifikánsan magasabb (p<0.001) spóraszámot eredményezett, mint a 12h fehér fény/ 12h közeli-UV. Mindazonáltal azon táptalajok esetében, melyen a folyamatos fehér fény kiváltotta a Ph. visci sporulációját (burgonya-dextróz, cukorszegény burgonya-dextróz, zabkivonat és V8-zöldséglé agar), a képződött konídium mennyiség hasonlóan alakult, köztük statisztikailag igazolható szignifikáns különbséget nem találtunk.

101 Amíg a 12h fehér fény/ 12h közeli-UV igen heterogén sporulációt váltott ki a különböző táptalajokon, addig a folyamatos fehér fénnyel való megvilágítás hasonló intenzitású sporulációt eredményezett (44. ábra és 13. táblázat ). A többi kombináció esetében a konídium képződés mértéke igen alacsony volt, bár V8-zöldséglé agaron 24 h folyamatos közeli-UV és zabkivonat agaron 12 h közeli UV/ 12 h sötét alternációja nyomán még viszonylag magas spóraszám képződött (1,4–1,7×10⁵ db/Petri-csésze), köztük szignifikáns különbség nem volt (p=0.99).

13. táblázat: A különböző fényhatások nyomán képződő spórák átlagos mennyisége (db/ Petri-csésze) az egyes táptalajokon.

Összességében megállapítható, hogy a Ph. visci izolátumainak sporulációs vizsgálatai pozitív eredménnyel zárultak, hiszen számos táptalajon különböző megvilágítások alkalmazása mellett a kórokozó viszonylag intenzív sporulációját tapasztaltuk.

A kísérleteink során sem tapasztaltuk a Ph. visci jelentős sporulációját a megvilágítás nélkül burgonya-dextróz agaron fejlődő izolátumokon, erre csak alkalmanként az idősebb, 6–8 hetes izolátumok esetében kerül sor, mely egybevág Stojanovič (1989) közlésével.

Érdekesség, hogy megfigyelései alapján e kórokozó megvilágítás nélkül inkubált izolátumai magasabb spóraszámot képeztek szilvakivonat agaron (30 g szilva, 20 g szacharóz, 15 g agar L^-1), ezt a táptalajt azonban nem vizsgáltuk.

SPORULÁCIÓ NŐ

102 Míg a Ph. visci sporulációjára a teljes sötétség gátlólag hatott, addig a spóraképzést a folyamatos közeli-UV alkalmazása sem befolyásolta kedvezően. Bár számos szerző a Spaeropsis fajok esetében a közeli-UV alkalmazásától teljesen eltekint (Palmer és mtsai 1987, Kim és mtsai 2005), addig Crous és mtsai (2006) ezzel a megvilágítással, valamint speciális vizes-fenyőforgács táptalaj alkalmazásával több, a Botryosphaeriaceae családba tartozó faj intenzív sporulációját érte el.

A közeli-UV folyamatos megvilágításának alkalmazása eredményes továbbá különböző Alternaria fajok (Rotem 1994, Masangkay és mtsai 2000), Septoria fajok (Cooke és Johnes 1970), Drechslera fajok V8-zöldséglé agaron nevelt izolátumai esetében is (Babadoost és Johnston 1998, Campbell és mtsai 2003). Kísérleteink során a Ph. visci fejlődése V8-agaron 24 h közeli-UV alkalmazása esetén nem, addig 24 h fehér fény és 12 h közeli-UV/12 h fehér-fény alternációja esetén igen kedvezően alakult.

Míg a folyamatos közeli-UV legtöbb esetben erősen gátolta a Ph. visci sporulációját, addig a folyamatos fehér fény elősegítette azt, hatása szinte valamennyi táptalaj esetén viszonylag kiegyenlített volt. A folyamatos megvilágítás számos további faj esetében kedvezően befolyásolja a sporuláció alakulását. Míg Palmer és mtsai (1987) a Sphaeropsis sapinea vizes-fenyőforgács agaron nevelt izolátumai, addig Kim és mtsai (2005) zabkivonat agaron nevelt Spaeropsis pyriputresces izolátumok esetében figyelte meg a folyamatos fehér fény kedvező hatásait.

A fehér fény és sötétség alternációját számos más kórokozók (pl. Fusarium, Drechslera) esetében hatékonyan alkalmazták (Raymond és Bockus 1982, Paparu és mtsai 2006), azonban a Ph. visci esetében nem eredményezett jelentős sporulációt. Csakugyan hatástalan volt a 12 h sötétség/ 12 h közeli-UV alternációja is, amit korábban eredményesen alkalmazta egy Fusarium faj esetében celofánnal fedett burgonya-dextróz agaron (Brown és Cook 2004).

Ugyancsak Fusarium izolátumok esetében figyelték meg az SN agar stimuláló hatását (Aoki és O‟Donnell 199), míg az S agar alkalmazása Alternaria fajok sporulációját segítette elő (Masangkay és mtsai 2000). Ez a két táptalaj a Ph. visci sporulációját csak kis mértékben indukálta, hatékonynak a zabkivonat agar, V8-zöldséglé agar, valamint burgonya-dextróz agar bizonyult, hasonlóan Palmer és mtsai (1987), Kim és mtsai (2005), valamint Xiao (2006) más Sphaeropsis fajokon végzett megfigyeléseihez.

103 Érdekesség, hogy az általunk leghatékonyabbnak talált zabkivonat agar és 12 h közeli-UV/ 12 h fehér fény kombinációt eddig egyetlen, a Ph. visci rokon faján nem vizsgálták, hiszen az alternáló megvilágítások közül egy 12 órás fehér fénnyel, vagy közeli-UV-vel történő megvilágítást inkább a világítás mellőzésével, mintsem egymással kombinálják.

Az eltérő megvilágítások és táptalajok interakciója nyomán nemcsak a sporuláció, de a Ph. visci telepmorfológiája is igen változatosan alakult (45. ábra).

Általánosan elmondható, hogy a kísérlet végére szinte az összes telepen erős szürkés, később fekete pigmentáció volt megfigyelhető, kivéve a megvilágítás nélkül zabkivonat agaron és 12 h fehér fény/ 12 h sötét megvilágításban SN agaron fejlődő telepek esetében.

Utóbbi táptalaj (SNA) és az S agar abban a tekintetben különleges volt, hogy rajtuk a Ph. visci telepei nem nőttek tovább. Ez a két táptalaj valóban csak a spórképzés kismértékű indukálására alkalmas, míg a tenyészetek fenntartására teljesen alkalmatlan.

A zonáció és a rozettás szerkezet inkább a fiatal, 7–14 napos izolátumokra volt jellemző, azonban ez a rozettás-jelleg a V8-zöldséglé és a celofánnal fedett burgonya-dextróz táptalaj esetben végig megmaradt, mely alternáló megvilágítások esetén még erősebben jelentkezett.

Burgonya-dextróz és cukorszegény burgonya-dextróz agarokon a telepek zónázottsága alig volt megfigyelhető, bár alternáló megvilágítás esetén néhol itt is (pl. BDA+ 12h fény/ 12 h sötét) előfordult.

A legegyöntetűbb telepmorfológiát minden esetben zabkivonat agaron figyeltük meg. Itt a telepek igen hamar benőtték a táptalaj teljes felületét, továbbá a micélium színe a megvilágítás mennyiségének növelésével arányosan egyre sötétebbre színeződött, hisz míg a megvilágítás nélkül tartott telepek szinte teljesen fehérek, addig az alternáló megvilágítás esetén világosszürkék, folyamatos megvilágítás (közeli-UV és fehér fény) esetén már jobbára piszkosszürke színűek voltak. Ezen a táptalajon sem a telepek rozettáltsága, sem a sporuláció zónázottsága még alternáló megvilágítás esetében sem volt megfigyelhető, a spórák mindig elszórtan, a telepek teljes felületén képződtek (45. ábra).

104 45. ábra: A Ph. visci változatos telepmorfológiája és sporulációja

különböző fényhatások és táptalajok interakciója hatására. (Fotó:Varga I.)

105 Azokat a megvilágításonként és táptalajonként megmaradt 4-4 db Ph. visci izolátumot, melyeken a képződött spóraszámot Bürker-kamrában nem határoztuk meg, további 14 napra 25°C-os sötét termosztátba helyeztünk, hogy vizsgáljuk a spórák csírázóképességét. A spórák csírázását 14 nap elteltével sztereomikroszkóp segítségével valamennyi sporuláló kombináció esetében vizuálisan értékeltünk.

A Ph. visci izolátumai az értékeléskor már 5 hetesek voltak, így a telepek valamennyi esetben sötétszürkére és feketére színeződtek. A lemezek felületéből a piknídiumok erősen kiemelkedtek és szabad szemmel is jól elkülöníthetőek voltak, ugyanis belőlük minden esetben nagy tömegben törtek elő a kórokozó frissen csírázó konídiumai (46. ábra). A spórák csírázása minden esetben elindult, melyek minden bizonnyal életképesek voltak, hiszen a fertőzési küszöbérték vizsgálatokat a spóraindukció során nyert spóraszuszpenzióval végeztük.

46. ábra: A spóraindukció nyomán képződött Ph. visci piknídiumai és a konídiumok csírázása. A: 30 ×, B: 45 ×, C: 15 ×, D: 20 × nagyítás. (Fotó: Varga I.)

106