6. E REDMÉNYEK ÉS K ÖVETKEZTETÉSEK
6.1 A fehér fagyöngy előfordulása Magyarországon
6.2.6 Mesterséges fertőzés és a fertőzési küszöbérték vizsgálatai
A mesterséges fertőzési kísérletek előtanulmányaként azt vizsgáltuk, hogy helytálló-e Karadžić és Lazarev (2005) megállapítása, mely szerint a kórokozó azokat a leveleket nagyobb arányban fertőzi, melyek felületén mikrosérülések találhatóak. Vizsgálataink során két intenzív növekedésű keszthelyi gyűjtésű monospórás tenyészet micélium korongjaival végeztük el a fertőzési kísérleteket ép és carborundummal kezelt fagyöngyleveleken. A tünetek valamennyi levélen az inokulálását követő 2. hétben megjelentek, melyek a 4. hétig tovább erősödtek (47. ábra).
47. ábra: A mesterséges fertőzési kísérletek előtanulmányakor képződött átlagos piknídium mennyiség carborundummal kezelt (szürke) és kezeletlen (fehér) fagyöngy leveleken a K1 (I.) és K2 (II:) izolátum alkalmazása esetén. A, C, F, H: levél felszíne; B, D, E, G: levél fonákja.
A varianciaanalízis alapján az ép és a carborundummal kezelt leveleken képződött piknídiumok összmennyiségében szignifikáns különbség nem volt kimutatható, vagyis a mikrosérüléseknek nem volt hatása a kórokozó fertőzésére és a képződött piknídiumok mennyiségére. Statisztikailag kimutatható különbséget 5 % szignifikancia szint mellet csak a levél színén található piknídium mennyiségében találtunk a különböző törzsek esetébent (F1,30=4.99, p=0.03). A képződött piknídiumok átlagos mennyisége a levél színén K1 izolátum esetében 359 (95% CI: 265–452) db, míg a K2 izolátum esetében 213 (95% CI: 120–307) db volt.
107 A korrelációszámítás elvégzése után arra a következtetésre jutottunk, hogy a fagyöngylevelek felülete és az piknídiumok összmennyisége között nincs sem lineáris, sem monoton kapcsolatot, a Pearson-féle korrelációs együttható illetve a Sperman-féle rangkorrelációs együttható egyaránt gyenge kapcsolatot mutatott (r= 0,26 mindkét esetben).
Az előtanulmányok eredményei alapján a Ph. visci további törzsek virulenciájának vizsgálatára során már kizárólag egészséges és sérülésmentes fagyöngyleveleket használtunk.
Eredményünk ellentmond ugyan Karadžić és Lazarev (2005) megfigyelésének, azonban esetükben az ép levelek tünetmentességét számos, a mikrosérüléseken kívüli egyéb tényező befolyásolhatta. Elképzelhető, hogy szabadföldi kísérlet során a hőmérséklet, vagy a páratartalom nem volt megfelelő, valamint a szerzők nem micélium korongokkal, hanem spóraszuszpencióval dolgoztak, mely koncentrációját munkájuk ismertetése során nem közölték, azonban ez is jelentősen befolyásolhatta a kísérlet sikerességét. Mindazonáltal sokáig elfogadott tény volt, hogy a Botryosphaeriaceae család fajai sebparazita kórokozók, melyek a nagyobb sebzéseken vagy a mikrosérüléseken tudnak eredményesen fertőzni (von Arx és Müller 1954, Smith és mtsai 1994). Mára azonban számos tanulmány bizonyította, hogy ezek a fajok ugyanúgy képesek behatolni sztómákon, hidatódákon és lenticellákon, így a kórokozó fertőzése sebzések megléte nélkül is sikeresen lezajlik (Brown és Hendrix 1981, Kim és mtsai 1999, Michailides 1991, Smith 2001, Slippers és Wingfield 2007).
A különböző törzsek virulenciját a fertőzést követően megjelenő piknídiumok számával mértük. A vizsgálatba bevont törzsek fertőzése nyomán képződött piknídium mennyiség igen változatos volt, átlagosan 7–58 db/cm2 között alakult (48. ábra és 15. táblázat), azonban a fertőzése nyomán képződött piknídiumok mennyiségében a varianciaanalízis szignifikáns különbséget nem mutatott (F10,32= 1.76, p= 0.11).
48. ábra: A különböző törzsek fertőzése nyomán képződött piknídiumok mennyisége (±SEM).
108 14. táblázat: A különböző Ph. visci törzsek fertőzése nyomán képződött piknídiumok
mennyisége és a fertőzés nyomán kialakult klorotikus tünetek alakulása.
Piknídium
+………….nagyon gyenge klorózis (kiterjedése kisebb, mint a levélfelület 25%-a), ++………..gyenge klorózis (kiterjedése a levélfelület 25–50%-a),
+++………erős klorózis (kiterjedése a levélfelület 50–75%-a),
++++……..nagyon erős klorózis (kiterjedése nagyobb, mint a levélfelület 75%-a).
Bár az eltérő törzsek fertőzése nyomán képződött piknídiumok átlagai között jelentős különbségek láthatóak, a vizsgálat során az adatok szórása igen nagy (48. ábra és 14.
táblázat), azonban az ismétlések száma viszonylag kicsi volt, így a varianciaanalízis vélhetően ezért sem tudott különbséget kimutatni.
Míg a törzsek között nem, addig a levelek színén és fonákán képződött piknídiumok mennyisége között szignifikáns különbséget tudtunk kimutatni (F1,87= 8.57, p<0.001), hiszen a levelek színén átlagosan 212 (95% CI: 156–267) db, addig a fonákon csak 96 (95% CI: 41–
152) db piknídium képződött a fagyöngylevelek nagyságától függetlenül (F1,41= 2.45, p=0.12).
A mesterséges fertőzések nyomán az előtanulmányokhoz hasonlóan a klorotikus tünetek, az inokulálást követően 7–10 nappal jelentek meg, míg a piknídium képződés az inokulálást követő 2. héttől erősödött. Számos esetben a piknídiumok megjelenése nem volt arányban a klorózis mértékével, mivel a levelek igen hamar kifehéredtek, vagy klorotikussá váltak, addig piknídiumok alacsony számban jelentek meg (pl. D törzs, Dombóvár).
109 Előfordult olyan eset is, amikor a klorózis mértéke alacsonyabb volt, és a piknídiumok igen korán, jóval a 14. nap előtt, a zöld növényi szöveteken jelentek meg.
A mesterséges fertőzési vizsgálatokról általánosságban elmondható, hogy az általunk alkalmazott körülmények (RH%, hőmérséklet) esetén a Ph. visci micélium korongról sikeresen fertőzte az egészséges fagyöngyleveleket. A betegség tünetei az inokulálást követően igen hamar megjelentek, majd kb. 1 hónapig folyamatosan erősödtek. A betegség tünetei és a képződött piknídium mennyisége hasonlóan alakult ép és carborundummal kezelt levelek esetén, vagyis a Ph. visci fertőzése sebzések megléte nélkül is sikeres volt.
A különböző törzsek alkalmazása esetén képződött piknídiumok mennyisége igen heterogén volt, azonban az adott törzsek esetében is igen nagy szórás volt megfigyelhető.
Éppen ezért a vizsgálatokat mindenképpen érdemes lenne egy nagyobb minta- és ismétlésszámmal is elvégezni, hogy az izolátumok virulenciájáról árnyaltabb képet kaphassunk, mivel jelen esetben a varianciaanalízis a törzsek között különbséget nem mutatott ki. Az adatok szórása miatt a mesgerséges fertőzési kísérletekkel kapcsolatban pontosabb következtetéseket nem kívánunk levonni, erre csak egy átfogóbb vizsgálat után kerülhet sor.
A Ph. visci fertőzési küszöbérték (NTI= numerical threshold of inoculum), vagy hígítási végpont vizsgálata számos, nemcsak a további laboratóriumi vizsgálatok, de a szabadföldi kijuttatás szempontjából is jelentős kérdésekre adhat választ, hiszen a fertőzéshez szükséges spóraszám kulcsfontosságú lehet a mikoherbicid fejlesztés szempontjából.
Vizsgálatainkhoz a spóraindukciós kísérletek során nyert spóraszuszpenziót tisztítottuk, majd centrifugáltuk, melyből egy folyamatosan töményedő spóraszuszpenzió sorozatot állítottunk elő. A 6 különböző koncentrációjú szuszpencióval egészséges fagyöngyleveleket fertőztünk, majd a mesterséges fertőzési kísérleteknél alkalmazott módon inkubáltuk a leveleket.
A betegség tünetei, hasonlóan a mesterséges fertőzési vizsgálatokhoz, kb. 10–14 nap után jelentek meg, majd fokozatosan erősödtek (49. ábra és 15. táblázat). Azokon a leveleken, melyeket töményebb spóraszuszpenzióval (1–2 × 105 db/ml) inokuláltunk, a betegség tünetei már 4–5 nap után megjelentek, valamint a piknídiumok képződése is előbb megindult, mint az alacsonyabb koncentrációjú szuszpenzióval kezelt levelek esetén. A magasabb koncentráció alkalmazása esetén a levelek az inokulálást követő 14. napra erősen klorotikusak voltak, rajtuk nagy tömegben képződtek a piknídiumok, melyekből számos esetben a 3. héttől a konídiumok csírázásnak indultak.
110 Az alacsonyabb koncentrációk esetén a klorotikus tünetek később jelentkeztek, illetve kiterjedésük is kisebb volt, mint ahogy azt az erősebb koncentrációval kezelt fagyöngyleveleken tapasztaltuk. Mindazonáltal már a legkisebb koncentrációjú szuszpenzió esetén is (6,5 × 103 db/ml) megelentek a tünetek, vagyis a fertőzés sikeres volt (49. ábra).
49. ábra: A fertőzési küszöbérték (NTI) vizsgálatai: a különböző koncentrációjú (A: 6,5 × 103; B: 1,25 × 104; C: 2,5 × 104; D: 5 × 104; E: 1 × 105; F: 2 × 105 spóra/ml)
Ph. visci spóraszuszpenziók által okozott tünetek 4 héttel az inokulálást követően.
(Fotó: Varga I.)
111 15. táblázat: A különböző koncentrációjú Ph. visci spóraszuszpenziók fertőzése nyomán
kialakult klorotikus tünetek alakulása a 14. és 28. napon.
Idő Spóraszuszpenzió koncentrációja (db/ml)
+………....nagyon gyenge klorózis (kiterjedése kisebb, mint a levélfelület 25%-a), ++………..gyenge klorózis (kiterjedése a levélfelület 25–50%-a),
+++………erős klorózis (kiterjedése a levélfelület 50–75%-a),
++++……..nagyon erős klorózis (kiterjedése nagyobb, mint a levélfelület 75%-a).
Bár a különböző koncentrációjú spóraszuszpenziók fertőzése nyomán képződött piknídiumok száma a koncentráció emelkedésével növekedett ugyan, a növekedés nem volt egyenesen arányos (16. táblázat és 50. ábra), illetve a képződött piknídiumok mennyiségében a varianciaanalízis sem mutatott szignifikáns különbséget (F5,18= 2.58, p=0.047). Mindazonáltal a szignifikancia közelített az 5%-hoz, így előreláthatólag magasabb ismétlésszám alkalmazása esetén statisztikailag is igazolható lenne a növekedés.
Bár a varianciaanalízis a koncentrációnkénti összpiknídium mennyiségben szignifikáns különbséget nem mutatott ki, addig a levelek színén képződött piknídiumok mennyisége minden esetben szignifikánsan nagyobb volt, mint a levelek fonákán képződötteké (F1,46=44.1, p<0.001).
16. táblázat: A különböző koncentrációjú Ph. visci spóraszuszpenziók fertőzése nyomán képződött piknídiumok átlagos mennyisége az inokulálást követő 28. napon.
Piknídium
112 50. ábra: A fertőzési küszöbérték vizsgálatok során képződött piknídium mennyisége
(±SEM) a levelek felszínén és fonákán, és az átlagos összpiknídiumszám (±SEM) a koncentrációk függvényében.
Érdekesség továbbá az is, hogy a levelek színén (246 [95% CI: 208–283]db) és fonákán (70 [ 95% CI: 33–108] db) képződött piknídiumok átlagos mennyisége hasonlóan alakult, mint a mesterséges fertőzés nyomán keletkező piknídiumoké, ahol szintén csak ebben a tekintetben lehetett szignifikáns különbséget kimutatni. A mesterséges fertőzési kísérletekhez hasonlóan a fertőzési küszöbérték vizsgálatok is megerősítették, hogy a levelek felszínén képződött piknídiumok összmennyisége nem függ a levelek nagyságától (F1,22=0.31, p=0.58).
Az elvégzett fertőzési küszöbérték vizsgálatok eredményei alapján megállapítható, hogy a Ph. visci fertőzése nemcsak in vitro módon előállított micélium koronggal, de spóraszuszpenzióval is lehetséges. A fertőzés már a legkisebb koncentrációban (6,5 × 103 db/ml) is sikeres volt az általunk alkalmazott légnedvesség és hőmérsékleti viszonyok mellett, mely a tavaszi időjárást kívánta modellezni. A 6,5 × 103 db/ml spóra alkalmazása átlagosan 211 db, míg a legmagasabb, 2 × 105 db/ml-es koncentráció átlagosan 423 db piknídiumot eredményezett. Bár a képződött piknídiumok mennyisége és a tünetek erőssége is a koncentrációval arányosan változott, mindezt statisztikailag nem tudtuk megerősíteni.
Laboratóriumi körülmények között valamennyi koncentráció alkalmazása eredményes fertőzéshez vezetett, így a szabadföldi kijuttatás során ezek a koncentrációk irányadóak lehetnek, azonban ezekban a kísérletekben is elsőként egy koncentráció-sorozattal lenne érdemes próbálkozni.
113