5. A NYAG ÉS MÓDSZER
5.2 A Phaeobotryosphaeria visci vizsgálatai
5.2.3 Mikológiai vizsgálatok
5.2.3.1 Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok
Az antibiotikum érzékenységi vizsgálatokat Ajkáról, ezüst juharról (Acer saccharinum) begyűjtött Ph. visci izolátumon (kód: 20/1; A) végeztük el. (Az izolátum gyors növekedése és a spontán sporulációs előtanulmányokat követően ezt az izolátumot választottuk a további laboratóriumi kísérletek nagy részéhez).
A különböző antibiotikumok és kombinációik Ph. visci telepnövekedésére gyakorolt hatásait burgonya-dextróz agaron öt ismétlésben vizsgáltuk. A vizsgált antibiotikumat az oldatok filtersterilizálását követően a 60°C-osra hűlt táptalajba kevertük.
A 7 napos tiszta tenyészetek aktív növekedési zónájából származó 5 mm átmérőjű agarkorongot helyeztünk el 90 mm-es Petri-csészékbe, majd a lemezeket 25°C-on sötét termosztátban inkubáltuk. A telepátmérőt 12 napon keresztül minden második nap mértük, kontrollnak az antibiotikumot nem tartalmazó lemezek fejlődését tekintettük (Karwa és mtsai 2008).
A vizsgálatok során felhasznált antibiotikumok koncentrációi a következők voltak:
(i) ampicillin 100 mg L-1,(ii) kanamicin 30 mg L-1, (iii) rifampicin 100 mg L-1, (iv) nisztatin 50 mg L-1.
Az antibiotikumok esetleges növekedésgátló hatásait továbbá az alábbi kombinációkban is teszteltük: (i) ampicillin és kanamicin, (ii) ampicillin és rifampicin, (iii) kanamicin és rifampicin, illetve (iv) ampicillin, kanamicin és rifampicin.
5.2.3.2 Növekedés szilárd és folyékony táptalajokon
A Ph. visci szilárd táptalajon való növekedését az antibiotikum érzékenységi vizsgálatokhoz hasonlóan Karwa és mtsai (2008) módszere alapján a következő táptalajokon vizsgáltuk öt ismétlésben:
(1) BDA: burgonya-dextróz agaron 20°C és 25°C-on, hogy megállapítsuk van-e különbség a növekedés intenzitásban és a telepátmérőkben ilyen alacsony hőmérséklet különbség esetén a későbbi sporulációs vizsgálatokhoz,
(2) ZA: zabkivonat agaron (100 g zabpehely felfőzve, 15 g agar L-1) 25°C-on,
49 (3) ¼ BDA+V8A: 25%-os burgonya-dextróz és V8-zöldséglé agaron (1 g burgonya kivonat, 5 g glükóz, 150 ml V8 zöldséglé (Campbell South Co.), 3 g CaCO3, 15 g agar L-1) 25°C-on. A táptalajok pH-ját 6,5-re állítottuk be.
A vizsgált táptalajokon kapott eredményeket összevetettük az általunk korábban tanulmányozott (Varga 2009) táptalajokon mért növekedéssel is.
A folyadék táptalajon való növekedést az alábbi tápleveseken vizsgáltuk:
(1) BDL: burgonya-dextróz táplevesen (4 g burgonya kivonat, 20 g glükóz L-1) és
(2) ZL: zabkivonat táplevesen (100 g zabpehely felfőzve L-1). A táplevesek pH-ját 6,5-re állítottuk be.
A folyékony táplevesen való növekedést 21 napon keresztül mértük 24 (3x8) ismétlésben mindkét táplevesen. Az inokulum előkészítése során 7 napos monospórás tenyészet (kód: 20/1; A) aktív növekedési zónájából származó ~5 mm átmérőjű agarkorongot oltottunk szemipermeábilis membránnal (celofán) borított BDA lemezre. Az inokulumok 5 napig növekedtek 25°C-os megvilágítás nélküli termosztátban. Az inokulumok nedves tömegét a táplevesre való áthelyezés előtt lemértük. Az 1000 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 200-200 ml táplevest öntöttünk, majd az inokulumok elhelyezését követően 20°C-os, fehér fénnyel (Standard light color 865 fénycső) megvilágított termosztátba (Binder ATP line KTM) helyeztük (14. ábra).
14. ábra: Ph. visci növekedése zabkivonat (felső) és burgonya-dextróz táplevesen (alsó).
(Fotó: Varga I.)
50 A vizsgálatok előtanulmányaként mindkét táptalajon 6-6 ismétlésben a fent leírt körülmények mellett teszteltük, hogy a rázatás (60 min-1) milyen hatással van a telepek fejlődésére. Az értékelés során minden 7. nap 8-8 Erlenmeyer-lombikot bontottunk fel, mértük a kultúrák telepátmérőit, nedves és száraz tömegét Prosser (1995) szerint.
Felvételeztük továbbá a makromorfológiai változásokat és az esetlegesen bekövetkező sporuláció meglétét is. A keletkezett spóraszám meghatározására a száraztömegek lemérése miatt nem volt lehetőség.
5.2.3.3 A sporuláció vizsgálata
A Ph. visci sporulációját az alábbi táptalajokon 8-8 ismétlésben vizsgáltuk:
(1) BDA: burgonya-dextróz agar,
(3) Cel BDA: szemipermeábilis membránnal (celofán) fedett burgonya-dextróz agar, (2) Csz BDA: cukorszegény burgonya-dextróz agar (4 g burgonya kivonat, 15 g agar L-1), (4) ZA: zabkivonat agar (100 g zabpehely felfőzve, 15 g agar L-1);
(5) ¼ BDA+V8A: 25%-os burgonya-dextróz és V8-zöldséglé agar, (6) SA: S agar (20 g szacharóz, 30 g CaCO3, 15 g agar L-1) és
(7) SNA: SN agar (KH2PO4 1g, KNO3 1g, MgSO4 x 7 H2O 0.26 g, KCl 0,5 g, glükóz 0,2 g, szacharóz 0,5 g, agar 15 g L-1). A táptalajok pH-ját 6,5-re állítottuk be.
A vizsgálatokat 90 mm-es Petri-csészékben végeztük, melyek 20-20 ml táptalajt tartalmaztak. Inokulumnak 7 napos monospórás tenyészetek (kód: 20/1; A) aktív növekedési zónájából származó 3-5 mm átmérőjű agarkorongot használtunk.
A BDA, Csz BDA, Cel BDA, ZA és ¼ BDA+V8A esetében az inokulumot közvetlenül a táptalajra helyeztük, majd a lemezeket 7 napig sötét, 25°C-os termosztátban inkubáltuk az intenzív micélium növekedés érdekében.
Mivel az SA és SNA táptalajok a Ph. visci telepei nem fejlődnek, ezért a megfelelő méretű telepek előállításához az inokulumot megelőzőleg szemipermeábilis membránnal borított BDA-ra oltottuk és ezen a táptalajon 7 napig sötét, 25°C-os termosztátban inkubáltuk.
A 7 napos telepeket közvetlenül a SA és SNA lemezekre oltottuk, majd a többi előkészített táptalajon fejlődő Ph. visci izolátummal együtt 14 napig 20°C-os termosztátban inkubáltuk.
51 Az inkubálás ideje alatt a következő megvilágításokat alkalmaztuk:
(1) 24 h sötét (megvilágítás nélkül),
(2) 24 h közeli-UV (NUV: Philips TLD 18W/08 fénycső, 300–400 nm) (15. ábra), (3) 24 h fehér fény (Standard light color 865 fénycső, 400–750 nm, 6400 K), (4) 12 h sötét/ 12 h fehér fény,
(5) 12 h sötét/ 12 h NUV és (6) 12 h fehér fény/ 12 h NUV.
15. ábra: Spóraindukciós előtanulmányok: Ph. visci izolátumok NUV alatt. (Fotó: Varga I.)
A képződött piknídiumokat 21 nappal az inokulálást követően 5-5 ml steril desztillált vízzel, üvegkacs segítségével lemostuk a lemezek felszínéről majd szuszpendáltuk. A képződött konídiumok mennyiségének meghatározásához megvilágításonként 4-4 Petri-csészét véletlenszerűen kiválasztottunk, majd fénymikroszkóp alatt, százszoros nagyítás mellett hemocitométerben (Bürker-kamrában) számoltuk a spóraszámot (Karwa és mtsai 2008). A spórákat a hemocitométer mindkét kamrájában megszámoltuk, átlagoltuk, majd következő módon visszaszámoltuk az 5 ml vízre, mellyel a 90 mm-es Petri-csésze felületéről a spórákat eltávolítottuk:
Az összes keletkezett spóra mennyiségének számítása:
52 A Petri-csésze 1cm2-én keletkező spóra mennyisége:
A spóraszám meghatározásán kívül a különböző megvilágítások és táptalajok hatására bekövetkezett telepmorfológiai változásokat (pl. sporuláció zónázottsága, micélium fejlődése, színbeli eltérések) is értékeltük.
A táptalajonként és fényhatásonként megmaradt 4-4 db Petri-csészét 14 napra visszahelyeztük 25°C-os sötét termosztátba, hogy vizsgáljuk a képződött spórák csírázási képességét, melyet vizuálisan értékeltünk.
5.2.3.4 Mesterséges fertőzés és fertőzési küszöbérték vizsgálatok
A mesterséges fertőzési kísérletek előtanulmányaként (16. ábra) Karadžić és Lazarev (2005) eredményeit vizsgáltuk felül, mely szerint a Ph. visci eredményes fertőzéshez a fagyöngylevélen mikrosérülések megléte szükséges.
16. ábra: Mesterséges fertőzés micélium koronggal. (Fotó: Varga I.)
53 A vizsgálat során két, keszthelyi gyűjtésű monospórás tenyészetet (K1, K2) használtunk.
Az inokulum előállításához 7 napos izolátumok aktív növekedési zónájából származó 3–5 mm átmérőjű agarkorongot szemipermeábilis membránnal fedett BDA lemezekre oltottunk, melyet 5 napig 25°C-on inkubáltuk, majd az így képződött friss micéliumut használtuk a mesterséges fertőzéshez.
Az inokulálást ép és a mikrosérülések előállítása céljából karborundummal kezelt fagyöngyleveleken végeztük 4 ismétlésben 8-8 levélen. A fagyöngyhajtásokat csapvízzel feltöltött, 1 dl űrtartalmú virágfiolába állítottuk, majd azt parafilmmel légmentesen lezártuk.
A növénymintákat inkubátorba helyeztük, ahol a relatív légnedvességet (RH) 75%-osra állítottuk be glicerin és víz azeotrópos keverék segítségével (Grover és Nicol 1940), majd 12 h fény/ 12 h sötét megvilágítás mellett 20°C-os termosztátban inkubáltuk. Ezen hőmérsékleti és légnedvességi értékekkel a tavaszi időjárást próbáltuk modellezni, hiszen Stojanovic (1989) szerint a spóraszóródás, valamint a fertőzés ekkor zajlik. A leveleket megnedvesítettük, majd rögzítettük a ~1,5 cm átmérőjű micélium korongokat. A frissen fertőzött leveleket kétszer nedvesítettük meg az első négy napban, majd 4 hétig inkubáltuk a növényeket.
Az előtanulmányokat követően az ország különböző pontjairól gyűjtött 8 monospórás tenyészettel (2. táblázat) 3 ismétlésben végeztük el a mesterséges fertőzési vizsgálatokat, ezúttal ép fagyöngy leveleken. A kísérleti körülmények, valamint a piknídiumok meghatározása az adatelemzés módja is megegyezett az előtanulmányoknál alkalmazottakkal.
A tünetek értékelése során ebben az esetben a kialakult klorózis mértkét a 2. és 4. héten felvételeztük és egy 0–4 skálán (0= nincs klorózis, 4= a levélfelület 100%-a klorotikus) értékeltük.
2. táblázat: A vizsgált minták gyűjtési helyei és kódjai.
Kód Gyűjtés helye V. album
gazdanövénye Kód Gyűjtés helye V. album gazdanövénye
A Ajka Acer saccharinum K3 Katafa Tilia sp.
B Bánhorváti Populus sp. K4 Körmend Acer saccharinum
D Dombóvár Acer saccharinum N Nagybajom Tilia cordata H Harkány Acer saccharinum R Rábagyarmat Tilia platyphyllos
*K1
*K2
Keszthely Acer saccharinum
Populus sp. Sz Szalonna Populus sp.
* Az előtanulmányok során vizsgált minták.
54 A fertőzési küszöbérték, más néven hígítási végpont vizsgálatok (NTI) során különböző koncentrációjú spóra szuszpenzióval fertőztünk egészséges fagyöngyleveleket in vitro körülmények között.
A fertőzéshez használt spóraszuszpenziót a megelőző spóraindukciós kísérletek során nyertük. A spóraszuszpenzió törzsoldatát 10 percig 5000 rpm sebességgel centrifugáltuk a micélium törmelék és a spórák szétválasztása érdekében. A centrifugálást követően a felülúszóval dolgoztunk tovább, melyből steril desztillált vízzel történő hígítást követően a következő koncentrációjú spóraszuszpenziókat készítettünk el: 6,5 × 103, 1,25 × 104, 2,5 × 104, 5 × 104, 1 × 105, 2 × 105 spóra/ml.
A vizsgálatokat 4–4 ismétlésben végeztük 4 különböző bokorról származó ép fagyöngylevélen. Az előzőleg 70%-os alkohollal fertőtlenített leveleket, melyek alá steril szűrőpapír került, kezelésenként különböző steril Petri-csészébe helyeztünk el, majd minden levél felszínére 2 × 50 µl szuszpenziót cseppentettünk. A növénymintákat inkubátorba helyeztük, ahol a relatív légnedvességet (RH) 75%-osra állítottuk be glicerin és víz azeotrópos keverék segítségével (Grover és Nicol 1940), majd 12 h fehér fény/ 12 h sötét megvilágítás (Standard light color 865 fénycső) mellett 20°C-os termosztátban (Binder ATP line KTM) 28 esetében korábban alkalmazott szisztémikus herbicid hatóanyagok (glifozát-izopropilamin só és 2,4-diklorofenoxi-ecetsav) hatóanyagok esetében vizsgáltuk, egy esetleges komplex herbicid-spóraszuszpenzió kijuttatása céljából.
A herbicid érzékenység vizsgálathoz a már kb. 50–60°C-osra hűlt burgonya-dextróz agarba kevertük az előzőleg filtersterilizált herbicideket, amelyek koncentrációi megegyeztek a szántóföldi normál dózissal, valamint annak felével és másfélszeresével. A koncentrációk a következőképpen alakultak:
(1) glifozát-izopropilamin só: 4,8 g/l; 9,6 /l; 14,4g/l;
(2) 2,4-diklorofenoxi-ecetsav: 3 g/l; 6 g/l; 9 g/l.
55 Vizsgálatainkat BDA-n 4 ismétlésben végeztük. Kezeletlen kontrollnak a herbicidet nem tartalmazó táptalajon fejlődő Ph. visci telepeket tekintettük. A kórokozó növekedését 12 napon keresztül Karwa és mtsai (2008) módszere szerint mértük.
5.2.3.6 A mikológiai vizsgálatok statisztikai értékelése
Az adatok feldolgozását a Microsoft Office Excel 2010 programban, statisztikai elemzést pedig az R program 2.15.1. verziójával (R Development Core Team 2012), míg az R szkriptumokat Tinn-R kódszerkesztő segítségével végeztük (Faria 2011).
Az elemzés során a micélium növekedésének jellemzésére, illetve a különböző faktorok hatása miatt bekövetkezett növekedés intenzitás változás megállapítására marginális regressziós modellt alkalmaztunk az “nlme” csomagból (Pinheiro és mtsai 2011). Ebben az esetben függő változóként a telepek átmérőit vettük, és a következő faktorokat használtunk fel kategóriás magyarázó változóként: marginális regresszió modell paramétereit az ún. restricted maximum likelihood (REML) becslési elv alapján határoztuk meg.
A statisztikai elemzést a folytonos magyarázó változó (napok) kihagyásával is elvégeztük. Az esetleges szignifikáns különbség megállapítására egyfaktoros varianciaelemzést (ANOVA) végeztünk, amely során az I. típusú (szekvenciális) négyzetösszegtípus szerinti felbontási elvet követtük. Az antibiotikumok esetében a 4., 8. és 12. napon, az antibiotikum kombinációk esetében a 10. napon, a herbicid koncentrációk esetében a 12. napon, a hőmérséklet esetében 4., 8. és 12. napon, a szilárd táptalajok esetében a 10. napon, valamint a folyékony táptalajok esetében pedig a 7., 14. illetve a 21. napon mért telepátmérők adatait vettük alapul. Szignifikáns különbség esetén az átlagokat Tukey-Kramer-féle próbával hasonlítottuk össze, melyhez az R program „DTK” csomagját használtuk fel (Lau 2011).
A főhatások és az interakciók finomabb elemzésére illetve az elsőfajú hiba (Type I error) elkerülése végett az elemzést megismételtük különböző kontrasztokkal is, aminek segítségével elsősorban azokat a szignifikáns különbségeket kerestünk, ami a kontroll illetve a
56 különböző kezelések között alakult ki. Az ún. treatment contrast-ot használtuk az egyes faktorszintek átlagának becslésére, amihez 95%-os konfidencia intervallumot (CI) is megadtunk.
Az összes elemzés elvégzése után ellenőriztük az adott próbára vonatkozó alkalmazhatósági feltételeket. A normalitás vizsgálatra elsősorban a Shapiro-Wilk próbát, a szóráshomogenitás vizsgálatra pedig a Bartlett-próbát használtuk fel 1 %-os szignifikancia szint mellett. Ezenkívül az adott modell illeszkedésének jóságát megvizsgáltuk különböző diagnosztikus ábrákkal is.
A mesterséges fertőzési vizsgálatok előtanulmánya során kétváltozós varianciaanalizissel értékeltük a kapott eredményeket. Az elemzés során az egyik faktor a kezelés típusa (ép és karborundummal kezelt levelek), a másik pedig az inokulumok (K1, K2) voltak. Ezen faktorok függvényében vizsgáltuk az összpiknídium mennyiséget, a piknídiumok mennyiségét a levelek színén és fonákján, valamint összefüggést kerestünk a levelek nagysága és a képződött piknídiumok mennyisége között. Az összes elemzés elvégzése után ellenőriztük az adott próbára vonatkozó alkalmazhatósági feltételeket.
A sporulációs, a mesterséges fertőzés és fertőzési küszöbérték vizsgálataink elemzése esetében is egyfaktoros varianciaanalízist (ANOVA) használtunk fel. Ebben az esetben a piknídiumok mennyiségét vettük folytonos függő változóként, kategóriás magyarázó változóként az egyes táptalajok típusait, a megvilágítást, az egyes spórakoncentráció mennyiségét, valamint a vizsgált törzseket. A spórakoncentráció esetében második faktorként a fagyöngylevél szerepét is figyelembe vettük, vagyis vizsgáltuk a piknídium mennyiségét egyaránt a levél színén és a fonákán is. Az elemzés további lépései megegyezik az előbb leírtakkal.
A statisztikai eredményeket különböző ábrákkal is szemléltettük. Oszlopdiagramokkal ábrázoltuk az egyes telepátmérőket a különböző faktorok függvényében. Regressziós egyenessel ábrázoltuk a telepátmérők növekedését az eltelt napok, illetve a különböző faktorok függvényében. Dobozdiagramot (boxplot) használtunk fel a piknídiumok mennyiségének adataiból számolt statisztika grafikus ábrázolására. A doboz közepén a vastag vízszintes vonal jelöli a mediánt, maga a doboz az interkvartilis terjedelmet (IQR) szemlélteti, a legkisebb és a legnagyobb értékek egy-egy talppal vannak ábrázolva. A doboz elhelyezkedése a teljes talphoz viszonyítva, illetve a medián helyzet a dobozon belül információt ad az eloszlásról. Minél kisebb az interkvartilis terjedelem, annál kisebb a variancia. Az önmagában álló üres körök jelölik a kiugró értékeket.
57