Rekonstruált filamentumok előállítása és felületi rögzítése

Rekonstruált filamentum megjelölés alatt monomer flagellinekből in vitro polimerizációval felépített filamentumot értünk. Kutatásaink fontos célja, hogy a flagellinalapú nehézfém-kötő receptorokból (Ni- és As-kötő flagellinekből) filamentáris receptor struktúrákat építsünk, ehhez a flagellin polimerizációs képességének ismerete elengedhetetlen.

Az irodalmi összefoglalóban említett korábbi vizsgálatok [HOMMA ÉS MTS., 1990]

megállapították, hogy a flagellinmolekulák terminális régiói hidrofób aminosavak hetes ismétlődéseit tartalmazzák, ami arra utal, hogy a térszerkezet kialakítása során ezek a régiók α-helikális kötegeket képeznek. A távoli UV-ban felvett CD spektrumon pedig látható, hogy a flagellinmolekulák polimerizációja során a rendezetlen régiók α-helikális szerkezetet vesznek fel. Mivel ezek a motívumok más fehérje-kölcsönhatásokban is gyakoriak, ezért azt feltételezték, hogy a flagelláris filamentumok képződése során az axiális irányban szomszédos alegységek α-hélix képző N- és C-terminális régiói egymással kölcsönhatásba lépve közösen formálnak helikális kötegeket. További feltételezésük az volt, hogy a helikális kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a folytonos filamentáris szerkezet kialakulását, úgy, hogy mindig a filamentum végén lévő szabad N-terminálishoz kötődik a következő alegység C-terminálisa. Ennek a feltételezésnek bizonyítására, fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) kísérleteket végeztünk, melyben a flagellinmolekula különböző méretben és terminálisán csonkított fragmentumait fluoreszcens festékkel (akceptor) jelöltük és beépülési képességüket vizsgáltuk egy szintén fluoreszcens festékkel (donor) jelölt filamentum kezdemény végére. A FRET, akkor jön létre, ha a gerjesztett állapotban levő energiát kibocsátó donor molekula emissziós spektruma átfedi egy energiafelvevő akceptor molekula abszorpciós spektrumát, a két kromofór közötti elektromos dipól-dipól kölcsönhatás egy nem sugárzásos energiaátadást eredményez.

A flagellinmolekula terminális régiói rendezetlenségüknél fogva könnyen emészthetők nagy specificitású proteázokkal, mint az Endoproteináz Lys-C (ELC) és Endoproteináz Glu-(V8), és tervezett módon eltávolíthatók, majd a különböző méretű fragmentumok FPLC ioncserélő kromatográfiával tisztíthatók. Az ELC kétszer hasít az N-terminálison, a 19. és az 58. helyen álló lizin után, eredményeképp egy 49 kDa méretű F49-es fragmentum jön létre és egy 46 kDa-os F46 fragmentum. A V8 enzim esetében az első hasítóhely a C-terminálison, a

kDa-os F48 és 44 kDa-os F44 fragmentumot kapunk. Kísérleteinkhez az F49, F48 fragmentumokat és tripszines emésztéssel előállított mindkét terminális részen csonkított flagellint, az F40-es fragmentumot használtuk fel (20. ábra) [GUGOLYA ÉS MTS., 2003].

20. ábra:Kötődési vizsgálat a különböző fragmentumokkal.

Az emésztetlen flagellinnel végzett kontrollvizsgálatok alapján az ép N- és C-terminálisok kötődésekor, a törzsoldatban lévő filamentumok végét borító Alexa 350-nel jelölt flagellinalegységek és az Alexa 488-cal jelölt flagellin monomerek között jött létre az energiatranszfer. A további kötődést vizsgálva, újabb de már Alexa 350-nel jelölt flagellin monomert adva ehhez az oldathoz, megint bekövetkezett az energiatranszfer, hiszen a filamentum végére kötődött Alexa 488-cal jelölt flagellinekhez képesek voltak odakötődni az újonnan odaérkezett Alexa 350-nel jelölt flagellinmolekulák(21. ábra).

0

400 450 500 550 600

Hullámhossz (nm)

21. ábra:A filamentum felépülésének vizsgálata fluoreszcens festékekkel jelölt flagellinekkel.

Az F49-es fragmentummal végzett kísérletek azt mutatták, hogy az F49-es fragmentum képes a flagellinhez kötődni, erre bizonyítékul szolgál az energiatranszfer (22.

ábra).

22. ábra: Az F49 fragmentum kötődésének vizsgálata.

Az Alexa 488-cal jelölt F48 nem mutatott energiatranszfert az Alexa 350-nel jelölt flagellinalegységekkel, ennek oka az, hogy az F48-as fragmentumnak a C- terminálisáról 33 aminosav hiányzik, ami emiatt nem tud kötődni a flagellin N-terminálisához, ezért energiatranszfer nem lép fel(23. ábra).

0

400 450 500 550 600

Hullámhossz (nm)

23. ábra:Az F48 fragmentum kötődésének vizsgálata.

Az F40-es fragmentum esetében sem tapasztalható energiatranszfer, kötődés nincs, hiszen a flagellinmolekula a proteolízis során mindkét terminális régióját elveszítette, ezért nem képes a-helikális kötegek kialakítására az emésztetlen flagellinmolekula N-terminálisával(24. ábra).

24. ábra:Az F40 fragmentum kötődésének vizsgálata.

0

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

Hullámhossz (nm)

400 450 500 550 600

Hullámhossz (nm)

Kísérleteink alapján elmondható, hogy a feltételezett modellt, miszerint a helikális kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a folytonos filamentáris szerkezet kialakulását, úgy, hogy mindig a filamentum végén lévő szabad N-terminálishoz kötődik a következő alegység C-terminálisa [HOMMA ÉS MTS., 1990] igazoltuk. A flagellinből előállított fragmentumok polimerizációs tulajdonságait fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer módszerrel vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy az N-terminálisán csonkított F49 képes volt a filamentumok végére beépülni. A magyarázat az, hogy az F49-es fragmentum C-terminálisa teljesen ép, ezért képes a filamentum végén levő flagellinalegység N-terminálisával a helikális köteg kialakítására. A mérések során az N- és C-terminálisok egymásba fonódását energiatranszfer jelezte, egy következő réteg F49 beépülése viszont nem történt meg, ugyanis a már kötött F49-es fragmentum N-terminálisáról 19 aminosav hiányzik, ami nélkülözhetetlen az újonnan odaérkező ép C-terminálissal rendelkező F49 bekötődéséhez.

Az F48 nem mutatott energiatranszfert a filamentumok végével, aminek az az oka, hogy az F48-as fragmentumnak a C-terminálisa erőteljesen csonkított, ezért nem tud kötődni a flagellin N-terminálisához. Az F40-es fragmentum esetében sem tapasztaltunk kötődést, de ez várható is volt, hiszen a proteolízis során mindkét terminálisát elveszítette, így egyáltalán nem tudott kötődni a filamentum végéhez [GUGOLYA ÉS MTS., 2003]. Ezzel a kísérlettel még több információt nyertünk a flagellin polimerizációjáról, amely további kutatásainkat is segítheti.

A polimerizáció ismerete mellett fontos célunk, hogy a nagy felületi kötőhely sűrűségű filamentáris receptor struktúrákat létrehozva, majd azokat optikai érzékelők felületére rögzítve olyan szenzorelemeket hozzunk létre, amelyek optikai úton képesek detektálni a mintában található nehézfémek kötődését. Előkísérleteket végeztünk annak kiderítése érdekében, hogy flagellinből épített filamentumok miként rögzíthetők különböző tulajdonságú felületeken. Különféle modellfelületek filamentummal történő beborítását vizsgáltuk.

Megfigyeléseink szerint a flagelláris filamentumok a sima tisztított üvegfelszínhez is egyik végüknél fogva erősen kitapadnak, s a felület nagy filamentumsűrűséggel (~ 60%-os borítottság) lefedhető. A tárgylemezt c=0.06 mg/ml koncentrációjú filamentum mintával 20mM Tris 150 mM NaCl (pH=7.8) pufferben 10 percig inkubálva fluoreszcens festékkel jelölt filamentumokat használva TIRFM (teljes belső visszaverődés fluoreszencia mikroszkóp) segítségével jelenítettük meg a beborított felületet. A teljes belső visszaverődés fluoreszcencia (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) mikroszkópiában pár száz nanométer magasságú gerjesztési mező jön létre, mely kiválóan alkalmas egyetlen molekularéteg fluoreszcencia gerjesztésére. A kísérleti elrendezésben ugyanazt a mintát felülről AFM segítségével pásztázzák, miközben alulról evaneszcens gerjesztés közben vizualizálják. Az atomerőmikroszkóp (AFM) nagy felbontású képalkotó módszer, melyben egy rugólapkán levő tűvel tapogatható le a minta felülete.

Magas lefedettséget tapasztaltunk még az 1%-os nitrocellulóz oldattal kezelt hidrofil felületek esetén is (25. ábra), c=0.06mg/ml koncentrációjú filamentum mintát alkalmazva 10 percig inkubálás után kb. 20%-os lefedettséget sikerült elérnünk és a flagelláris filamentumok teljes hosszukban feküdtek rá a hidrofil felületre, kitapadásuk erőssége lehetővé tette, hogy atomerő mikroszkópiával jellemezhessük a felület lefedettségét. Mindez azt jelenti, hogy ha a felületet a Ni-kötő filamentumokkal borítanánk, a kötőhelyek átlagos sűrűsége ~10⁴/μm² lenne.

25. ábra: Flagelláris filamentumokkal borított nitrocellulóz felszín 3D AFM-es felvétele.

[SEBESTYÉN ÉS MTS., 2006].

Az AQUANAL PROJEKT keretében glutár-aldehides keresztkötéssel, szilanizált SiO2

illetve Ta2O5 felszínre is sikerült kovalensen az aminocsoportokon keresztül filamentumokat rögzíteni, ebben az esetben is nagy lefedettséget tapasztaltunk. Ehhez a munkához kapcsolódóan az MFA munkatársai olyan folyadékcellát fejlesztettek, amelyben az immobilizáció is folyadékfázisban történhet, így olyan aspecifikus kitapadások is elkerülhetők, amelyek a száraz rögzítéskor felmerültek.