A klónozás és a génamplifikációs eljárások

Bármilyen klónozási eljárás célja, hogy egy ún. klónt, azaz tökéletesen egyforma szervezetek csoportját állítsa elő. A génklónozási kísérletekben rendszerint baktériumsejtbe viszik be az idegen gént, majd a módosított baktériumok szaporításával klónt hoznak létre. A klónozott sejtek mindegyike tartalmazza a bevitt idegen gént, és amíg biztosított a gén replikációja, a gazdasejt klónozásával klónozzák a gént is [WEAVER & HEDRICK 2000]. A génsebészetben használt klónozó vektorok sokfélék lehetnek, bakteriofágok, mesterséges kromoszómák, plazmidok és ezek hibrid származékai, a kozmidok.

A baktérium gazdasejt esetében a vektorok általában 3-6 kilobázis nagyságú extrakromoszómális, gyűrű alakú DNS-molekulák (plazmidok) lehetnek. A plazmidok a kromoszómától függetlenül, önállóan replikálódni képes cirkuláris DNS molekulák, amelyek nagyon sok baktériumfajban természetes módon előfordulnak. Általában olyan különleges tulajdonságokat kódoló géneket hordoznak, amelyek a környezethez való jobb alkalmazkodást segítik, de nem szükségesek minden körülmények között a gazdaszervezet életben maradásához (nehézfém rezisztencia, toxintermelés, antibiotikum rezisztencia, speciális anyagcsere utak, restrikciós-modifikációs rendszerek, patogenitás). Kis méretük miatt viszonylag könnyű a sejtekből láncszakadás, összetöredezés nélkül kinyerni őket. Egy sejtben a plazmidból általában több példány, akár több száz kópia is lehet, ettől függően nevezik őket kis vagy nagy kópiaszámú plazmidoknak. Napjainkban számtalan, in vitro rekombináns DNS technikával mesterségesen "összeállított" plazmid létezik, amelyek a génizolálás, a DNS szekvenálás, a génexpresszió vizsgálata vagy fehérjék termeltetése terén egyaránt hasznos eszközök.

A géntechnológia másik legfontosabb eszközei a restrikciós endonukleázok, amelyek specifikus, úgynevezett palindrom (elölről és hátulról olvasva azonos) szekvenciákat hasítanak. A restrikciós endonukleázok felfedezéséért W. Arber, H. Smith és D. Nathans részesült Nobel-díjban (1978). E. coliban figyelték meg őket, nevüket arról kapták, hogy megakadályozzák az idegen DNS invázióját, a molekula feldarabolásával. A restrikciós enzimek legfőbb előnye, hogy reprodukálhatóan, mindig ugyanott vágják el a DNS-t és a restrikciós fragmensek jellegzetes ujjlenyomatot alkotnak, ráadásul sokuk nem egymással szemben vágja el a DNS-szálat, hanem kissé eltolódva, tehát egyfonalas túlnyúló szálakat képez ún. ragadós végeket, így ezek könnyen összekapcsolódnak egymással [BÁLINT 2000].

A plazmid vektorba is ezeknek a ragadós végeknek a segítségével építik be az idegen DNS-darabot, mégpedig úgy, hogy a plazmidot adott helyen megfelelő restrikciós endonukleázokkal elhasítják, ilyenkor a plazmid egy helyen hasad, és komplementer ragadós végek keletkeznek. Ha a beillesztendő DNS-darabot is ilyen restrikciós enzimmel kezelik, akkor annak is ugyanilyen ragadós végei lesznek, majd a hasadási helyeken elvágott láncok a DNS ligázok segítségével újra egyesíthetők. A DNS-ligáz enzim feladata, hogy létrehozza a foszfodiészterkötést, és kialakítsa a folyamatos DNS szálat. Így a két enzim együttes alkalmazása lehetőséget teremt a gének „szabására-varrására”, sőt mi több, új, tetszőleges DNS-szakaszok beépítésére is. Berg (Nobel-díj, 1980), Boyer és Cohen úttörő munkássága a hetvenes évek elején a rekombináns DNS technika kifejlesztéséhez vezetett. Ennek lényege az, hogy új génszakaszok és gének állíthatók elő laboratóriumi körülmények között. Az új génkombinációk klónozhatók –vagyis megsokszorozhatók– megfelelő sejtekben a gazdasejt saját DNS-szintetizáló mechanizmusa révén, az új gének átírhatók és a transzlációt követően új fehérjék állíthatók elő.

8. ábra: A pGFP-fliC vektor térképe a NebCutter programmal tervezve, afliC HindIII-BamHI helyen aza jelű 495 aminosavnyi részt kódoló szegmens.

A kísérleteimben használt egyik plazmid a pGFP, egy pUC alapú vektor volt, melyben a fliC gén a HindIII- BamHI (New England Biolabs) helyre van beligálva (8. ábra). A D3 domén génjét pedig egy pET21c nevű (Novagen) vektorba klónoztam NheI-NotI (Fermentas) restrikciós enzimek segítségével.

Ahhoz, hogy a genom egy, kitüntetett szakaszát vizsgálni tudják (pl. szekvenálni), a megfelelő DNS-szakasznak nagy kópiaszámban kell rendelkezésre állnia. Kismennyiségű DNS felszaporítása kétféle stratégiával történhet. Az egyik in vivo módszer, melyben a vizsgálandó DNS vektorba építhető, majd baktériumban megsokszorozható. A másik módszer a polimeráz láncreakció (PCR), amelyben egy kívánt DNS-szakasz rendkívüli hatékonysággal in vitro rendszerben szaporítható fel.

A transzformáció (9. ábra) a genetikai rekombinációnak az a formája, melynek során a sejt a környezetéből idegen DNS-t vesz fel és a rajta elhelyezkedő géneket, beépíti saját genetikai anyagába. A sejt az így szerzett új jelleget tovább örökíti. Transzformáció során a baktériumok aktív, energiaigényes mechanizmussal veszik fel környezetükből a DNS-t.

Kiderült, hogy nem minden sejt képes felvenni DNS-t csak az ún. kompetens sejtek, a kompetenciaállapot a sejtnek azt a fizikai állapotát jelöli, melyben fel tudja venni a DNS-t.

9. ábra:A transzformáció folyamatábrája.

A génsebészeti technikák kifejlesztésében nagy szerepe volt az E. coli transzformáció kidolgozásának. Ca²⁺ ionok hatására az E. coli sejtfelszín lipopoliszacharid rétege változásokat szenved, de hogy milyen módon jut a DNS a gazdasejtbe, még ma sem igen ismert mechanizmus. A Salmonella esetében a lipopoliszacharid réteg viszont a nem Ca²⁺

ionok, hanem elektroporáció hatására válik átjárhatóvá. A transzformánsok szelekciója azon alapul, hogy a plazmid DNS-t felvett sejtek szelektálható markert, pl. antibiotikum

rezisztenciagént tartalmaznak, ezért képesek növekedni antibiotikum tartalmú táptalajon is, ahol a nem transzformált sejtek elpusztulnak.

Kísérleteim során a transzformációhoz E. coli TOP10 (Invitrogen), XL1-Blue (Stratagene), BL21 (DE3) pLysS és Salmonella SJW2536 flagellin deficiens törzseket használtam. A transzformációt az E. Coli törzsek esetén CaCl2-os kezeléssel [SAMBROOK &

RUSSEL, 2000], a Salmonella esetében elektroporációval végeztem elektroporátor készülék segítségével (BioRad Gene Pulser).

Egy kívánt génszakasz homogén formában történő szaporítása klónozás útján hosszú, munkaigényes folyamat. De létezik egy olyan módszer, amely nagyon gyorsan automatizálva is képes egy kívánt DNS-szakasz akár milliószoros mennyiségre történő sokszorosítására (10.ábra), ha annak szekvenciája legalább az elején és a végén ismert, ez a polimeráz láncreakció (PCR), melynek módszerét 1984-ben Kary Mullis fedezte fel [BÁLINT, 2000].

A szekvencia ismeretében DNS-szintetizátorban két olyan 20-25 tagú egyszálú oligonukleotidot (primer) készítenek, amelyek komplementerek a kérdéses DNS-darab egyik illetve másik láncának 3’-végével, ezek töltik be a primer szerepét. A reakcióelegy tartalmazza a sokszorosítani kívánt DNS-mintát, a nagy moláris feleslegben levő primereket és a négy dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátot (dNTP) és egy olyan DNS-polimerázt, amely igen nagy hőmérsékletű hőforrásokban élő baktériumból származik (Taq polimeráz, Pfu polimeráz) és ezért nagy a hőtűrése. Aktivitását megőrzi olyan hőmérsékleten is, amikor a DNS denaturálódik. A DNS-polimeráz a primereket képes folytatni, ehhez a DNS egy-egy szálát használja mintaként, aminek irányítása alatt elkészülnek az új DNS-szálak. Az egymás után beépülő nukleotidok kiválogatása a templát szál segítségével a Watson-Crick bázispárosodás törvényei alapján történik. Így az újonnan képződő szál a templát DNS-sel kettős hélixet alkot. Minden ismert DNS-polimeráz a 3’OH-hoz tud dNTP-t hozzákapcsolni (a dNTP-ből pirofoszfát kihasadása mellett), ezért a láncnövekedés mindig 5’→3’ irányú [BÁLINT, 2000].

A reakcióelegy hőmérsékletét körülbelül 95 ^oC-ra emelve a DNS denaturálódik, két lánca elválik egymástól. A reakcióelegyet alacsony hőfokra hűtve a nagy moláris feleslegben levő szintetikus primer molekulák hibridizálnak a megfelelő lánccal. A reakcióelegyet a polimeráz aktivitásának megfelelő hőmérsékleten tartva az enzim megszintetizálja a primerek folytatását képező láncokat, és így az eredeti DNS megkétszereződik.

Egy újabb ciklus elindítható a reakcióelegy ismételt felmelegítésével. Ekkor az újonnan szintetizált DNS-molekulák ismét denaturálódnak és így az eredetinél már kétszer több mintát (templát) szolgáltatnak a reakcióhoz. Hűtés után a nagy feleslegben jelen levő primer ismét hibridizál a megfelelő láncokkal és a polimeráz láncreakció végbemegy, ennek végén a DNS mennyisége ismét megkétszereződik. A ciklus 20-25-ször ismételhető meg, a folyamat végén a DNS mennyisége 2ⁿ-szeresére növekszik (n a ciklusok száma).

10. ábra:A PCR folyamatábrája.

A polimeráz láncreakciót ma már rutinszerűen használják a diagnosztikában és az igazságügyi orvosi gyakorlatban. Esetemben a reakciót a D3 domént és a flagellint kódoló DNS amplifikálására, illetve az irányított mutagenezishez használtam, a részletes körülményeket a kísérletek leírásánál ismertetem.