4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
4.6. D3 domén vázfehérje klónozása és vizsgálata
4.6.2. A D3 domén vizsgálata DSC-vel, CD-vel és proteolízissel
Tisztítást követően a fehérjén stabilitási vizsgálatot végeztem differenciális pásztázó mikrokalorimetria (DSC) módszerrel. A méréshez alkalmazott készülék szoftvervezérelt MicroCal VP-DSC volt. A méréseket 10 mM PB pH=7 pufferben végeztem 1 oC/perc felfűtési sebességgel 20-60 oC között. A fehérjekoncentráció 0.3 mg/ml volt, felfűtéskor egy éles endoterm csúcsot kaptam, 46oC-os csúcshőmérséklettel (28. ábra). A második felfűtés hasonló jelleget mutatott, tehát a fehérje reverzibilis denaturációt szenvedett, képes volt újra feltekeredni.
A méréseket pH=4 (29. ábra) és pH=11-en (30. ábra) megismételtem és hasonló görbéket kaptam.
28. ábra:A D3 domén (pH=7) felfűtésekor kapott görbék, a folytonos vonal az első, a szaggatott vonal a második felfűtést jelzi.[SEBESTYÉN ÉS MTS., 2008].
29. ábra: A D3 domén (pH=4) felfűtésekor kapott görbék, a folytonos vonal az első, a szaggatott vonal a második felfűtést jelzi.
30. ábra: A D3 domén (pH=11) felfűtésekor kapott görbék, a folytonos vonal az első, a szaggatott vonal a második felfűtést jelzi.
A D3 domén DSC vizsgálatai azt mutatják, hogy stabil harmadlagos szerkezettel rendelkező önálló fehérje, amelyet többszöri felfűtés és pH változás esetén is megtart. A kalorimetrikus és Van’t Hoff entalpia egyenlőségéből adódóan elmondható, hogy kétállapotú önálló folding doménként viselkedik.
A CD méréshez használt műszer egy JASCO J-720 típusú spektropolariméter volt. A mérést 1 mm-es vastagságú, 200 ml-es küvettában végeztem. A fehérje koncentrációja 0,15 mg/ml volt. A mérések kezdetén felvettem a 10 mM PB pH=7 puffer alapvonalát 185 és 260 nm között, amelynek célja elsősorban a küvetta tisztaságának ellenőrzése volt.
A spektrum mérésekhez használt protokoll a következő volt: 260 nm-től 185 nm-ig vettem fel a CD-jelet 10 nm/perc sebességgel. A pontok 0.2 nm-enként követték egymást, a válaszidő 4 sec, a csatornaszélesség 20 nm, az érzékenység pedig standard volt. A CD mérés során felvett spektrum a következőnek adódott (31. ábra)
31. ábra: A D3 domén távoli UV-ban felvett CD spektruma.
[SEBESTYÉN ÉS MTS., 2008].
A flagellinmolekula hipervariábilis D3 doménjének távoli UV-ban (185-260 nm) felvett CD spektruma egy random polipeptidnek megfelelő jelet mutatott, hasonlóan az irodalomból ismeretes flagellin emésztésekor kapott F27 fragmentum esetében.
A filamentok előnyös tulajdonsága, hogy ellenállnak a proteázoknak és fizikailag is stabilak. Viszont ha a D3 domént kívánjuk alkalmazni önmagában mesterséges fehérjék vázelemeként szintén fontos követelmény a stabilitás. Proteolitikus emésztéssel szerettem volna megmutatni, hogy mennyire ellenálló a D3 domén. A tripszin arginin és lizin után hasít, a D3 domén 8 lizin aminosavat tartalmaz, melyek mellett a tripszin hasíthat. A kísérletet 10 mM PB, 150 mM NaCl pH=7 pufferben végeztem, szobahőmérsékleten. A fehérje koncentrációja 0.15 mg/ml volt, a fehérje tripszin arány pedig 300:1 (m/m). A mintavétel a kiindulási (0) mintából, majd 10 perc (10), 20 perc (20), 30 perc (30), 1 óra, 2 óra, 4 óra múlva történt és a mintákat SDS –gélelektroforézissel ellenőriztem (32. ábra).
32. ábra: A D3 domén tripszines emésztési vizsgálata.
[SEBESTYÉN ÉS MTS., 2008].
A D3 domén 8 lizin aminosavat tartalmaz, mégis nagyfokú ellenállást mutat a tripszines emésztéskor. Korábbi vizsgálatok alapján a monomer flagellin rendezetlen régiói tripszinnel történő kezelésekor teljesen degradálódnak 1 perc alatt, és előáll az F40-es fragmentum, majd továbbemésztve megkapjuk az F27-es fragmentumot (33. ábra).
33. ábra: SJW1103 FliC emésztése tripszinnel.
[YOSHIOKA ÉS MTS., 1995].
A D3 doménnél, az intakt fehérje sávja látszik 4 óra múlva is, ami azt jelzi, hogy a D3 doménben a lehetséges hasítóhelyek el vannak temetve, és az enzim nem fér hozzá. Ez a megfigyelés szintén arra utal, hogy a D3 domén egy kompakt, jól feltekeredett harmadlagos szerkezettel bír. A D3 domén kis mérete és a stabil szerkezete lehetővé teszi, hogy mesterséges kötő fehérjék vázelemeként alkalmazhatóvá váljon, a későbbiekben pórusos szilíciumba zárva szenzorként alkalmazható legyen.
5. ÖSSZEFOGLALÁS
A környezetvédelemben kiemelt jelentőségű a szennyvizek, talaj- illetve felszíni vizek minőségének ellenőrzése, a toxikus anyagok (peszticidek, nehézfémek, klórozott szénhidrogének) szintjének meghatározása környezeti mintákban. Kiemelt fontosságúvá válik olyan módszerek kidolgozása, amelyek a szennyezések gyors, megbízható és valós idejű kimutatására szolgálnak. A kutatások egyre inkább a bioszenzorok irányába mutatnak, amelyek egy molekuláris felismerést biztosító biológiai eredetű felismerő részből és egy fizikai-kémiai jelátvivő egységből állnak.
Mivel a fehérjék rendkívül specifikus molekula felismerésre képesek, és számos mikroorganizmusban találhatók olyan fehérjék, amelyek átmeneti és nehézfém ionok erős és szelektív megkötésére, azok közegbeli koncentrációjának precíz érzékelésére képesek, bioszenzorok alapelemeiként érzékelési feladatokra használhatók. Ötvözve ezt a sajátságot önszerveződésre képes fehérjékkel, együttesen kiválóan alkalmazhatók molekuláris objektumok építésére.
Kutatásaink egy újfajta megközelítési módot kínálnak a nehézfémion szennyezők kimutatására. Kísérleteimben megmutattam, hogy a flagellin polimerizációs képességének megőrzése mellett a D3 domén szerkezetének számítógépes molekulamodellezésen alapuló módosításával nehézfémionok megkötésére képes receptorfehérjék állíthatók elő. Munkám során Ni- és As-kötő flagellineket állítottam elő génsebészeti eszközök segítségével, a mutáns flagellinek Ni- és As-kötő tulajdonságait vizsgáltam, és megállapítottam, hogy monomer formában erősen kötik az adott nehézfémiont. Előkísérleteink alapján látszik, hogy a flagellin receptorokból képzett, nagy felületi kötőhelysűrűséggel rendelkező filamentumok alkalmas hordozóra egyszerűen rögzíthetők, emellett filamentáris formában optikai úton is kimutatható a nehézfémion kötés. A D3 doménnal végzett kísérleteimből látszik, hogy a D3 domén, önmagában is stabil szerkezetű, ezért akár önállóan is mesterséges receptorok vázeleméül szolgálhat.
A D3 alapú receptorok főként a kis méretük miatt lehetnek előnyösek, de az eddig ismeretes mesterséges fehérjereceptorokhoz képest igazán figyelemre méltó előnyöket, a D3 doménjükben módosított flagellinreceptorok előállítása és alkalmazása ígér. Elsősorban azért, mert a mesterséges flagellinreceptorokból filamentáris receptorstruktúrák építése válik lehetővé. Egyfajta flagellinből a polimerizációs folyamat precíz kontrollálásával kívánt
amelyek több száz, de akár több tízezer alegységet is tartalmazhatnak. Ezen filamentumok felületén rendkívül nagy kötőhelysűrűség érhető el, a kötőhelyek távolsága kb. 5nm. Így az egyes receptoralegységek megfelelő sűrűségű térbeli elhelyezéséhez nincs szükség speciális hordozó mátrixra, s további előnyt jelent, hogy a filamentáris szerkezetet alkotó receptoregységek azonos lokális környezetben találhatók. A nagy kötőhelysűrűség még kis molekulatömegű ligandumok esetén is (pl. nehézfémionok) reményt nyújt a kötődés a kimutatásra, s alacsony koncentrációjú anyagok megkötését is lehetővé teszi.
Kutatásaink hosszú távú célja olyan optikai szenzorok előállítása és vizsgálata, amelyek ilyen filamentáris receptorokat használnak érzékelő elemként.