4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
4.1. Nehézfém-kötő flagellinvariánsok létrehozása
A flagellinben létrehozott kötőszegmensek kialakítása kétféle módon történt. A molekula ismert térszerkezetét felhasználva tudatos tervezéssel, Ni-kötő helyeket hoztam benne létre hisztidin aminosavak beillesztésével, illetve egy természetben előforduló az arzénkötő fehérjéből (ArsR) ismert kötőrégiót illesztettem be a molekula alkalmas helyére.
A természetes Ni-kötő fehérjékben a Ni-ionok koordinálását általában több (2-4) hisztidin oldallánc imidazol csoportja végzi. Ezt az ismeretet felhasználva a flagellinmolekula ismert térszerkezetéből kiindulva, számítógépes grafika és molekulamodellezés alkalmazásával megvizsgáltam, hogy a flagellin variábilis D3 régiójában mely aminosavak oldalláncai vannak megfelelő orientációban és távolságban ahhoz, hogy helyspecifikus mutagenezissel hisztidinre cserélve őket, fémkötő centrumot alakíthassak ki. A flagellin Protein Data Base (.pdb) file-ját felhasználva, melyben az atomi koordinációk adottak, a Protein Explorer segítségével meghatározható, hogy mely pozíciókban megfelelő az elhelyezkedés a cseréhez. A MODELLER program segítségével a modellezni lehet a molekula várható szerkezetét a cserét követően. Az alábbi oldallánc-kombinációk hisztidinre való cserélése mellett döntöttem:
1. Leu 209, Val 235, Lys 241 2. Leu 209, Gly 211 és Lys 241
3. Leu 209, Val 235, Lys 241, Ser 264 (15. ábra)
Ezeken kívül a D3 domén külső felszínén található Thr239 és Gly240 aminosavak közé egy (His)6 hexapeptid beépítését is terveztem. (15. ábra)
15. ábra: A Thr239-(His)6-Gly240 mutáns flagellin (balra), a Leu 209, Val 235, Lys 241, Ser 264 aminosavak His cseréjével kialakított flagellin D3 doménje (jobbra).
A tervezett Ni-kötő flagellinvariánsokat, a QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit segítségével állítottam elő. Kiindulva a már korábban elkészített pGFP-FliC plazmidból a következő a mutációkat tartalmazó primerekkel készítettem el a mutáns plazmidokat.
BackwardFliC His209: 5’ GTC AGT ACC ATG ACC AGT AGC CG ForwardFliC His209: 5’ CG GCT ACT GGT CAT GGT GGT ACT GAC
BackwardFliCHis209,211: 5’ CTG GTC AGT ATG ACC ATG ACC AGT AGC CG ForwardFliCHis209,211: 5’ CG GCT ACT GGT CAT GGT CAT ACT GAC CAG BackwardFliCHis235: 5’ CCA GTT CCC CCC GTA TGG GTA ACT TTG G ForwardFliCHis235: 5’ CC AAA GTT ACC CAT ACG GGG GGA ACT GG BackwardFliCHis241: 5’ CAT AAT AGC CAT CAT GAC CAG TTC CCC CCG ForwardFliCHis241: 5’ CGG GGG GAA CTG GTC ATG ATG GCT ATT ATG BackwardFliCHis264: 5’ CCT GTA AGC GGG TGA GTC GCA CCG CC ForwardFliCHis264: 5’ GGC GGT GCG ACT CAC CCG CTT ACA GG
Ezekből a primerekből ~125 ng-nyit (1,6 μl-t a 10 pmol/μl törzsoldatból) hibridizáltattam a klónozott kettősszálú ~25 ng-nyi (2 μl-t a 10 ng/ μl-es plazmidból) pGFP-fliC templáttal, a primerek folytatását 1 μl (2.5 U/μl) PfuTurbo DNSpolimeráz végezte -amely nagyfokú hibajavító aktivitással rendelkezik- az 1μl-nyi dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátok (dNTP) felhasználásával, PCR segítségével. A reakcióhoz kellett még 5 μl 10x-es reakciópuffer (amely tartalmazott 100mM KCl-t, 100mM (NH4)2SO4-t, 200mM Tris-HCl
(trisz-(hidroximetil)-amino-metán) (pH=8,8), 20mM MgSO4-t, 1% Tritont, és 1mg/ml BSA-t,), és steril desztillált víz (az egész reakcióoldatot 50μl-re kiegészítve).
A kit egy aminosav cseréjéhez a következő programot ajánlotta:
1. 95 °C 30 másodperc 2. 95 °C 30 másodperc 3. 55 °C 1 perc
4. 68 °C 5 perc (1 perc/ a plazmid mérete kb-ban) a 2-4 lépést 16 cikluson keresztül ismételni 5. 4°C 10 perc
A reakciót követően a PCR-termékeket megvizsgáltam agaróz gélen, egy éles sávot tapasztalva megfelelőnek találtam a transzformációhoz. A transzformáció előtt a PCR-terméket DpnI (10U/μl-ből 1μl) enzimmel emésztettem 1 órát, erre azért volt szükség, hogy a metilált nem mutáns DNS-t elemésszem, ugyanis az in vitro módon előállított mutáns DNS nem metilált.
Ezt követte a transzformáció, azaz a mutáns DNS bejuttatása XL1-Blue szuperkompetens sejtekbe, az előre elkészített kompetens sejtek tárolásánál fontos, hogy -80
oC-on kell tárolni őket, különben elveszítik aktivitásukat. A sejteket óvatosan felolvasztottam jégen, majd 50μl-es adagokra osztottam szét, amelyekhez hozzámértem a DpnI-el emésztett PCR-terméket (1μl). Ezt a transzformációs reakcióelegyet összekeverve 30 percet inkubáltam jégen, majd 45 másodpercig 42 oC-os hősokk következett, amely a rezisztencia gén kifejeződését segíti elő. Ezután 2 percre visszatettem jégre, és 0,5 ml folyadék táptalajt adtam minden elegyhez, ezt követte 1 órás inkubálás 37 oC-on, majd ampicillin-tartalmú (100 μg/ml, Sigma) lemezre kentem ki az egyes klónokat, és 37oC-on növesztettem őket. A kinőtt telepekből, plazmid preparálás és tisztítás következett plazmid tisztító kit segítségével. A plazmidot alkalikus lízis módszerrel nyertem ki a sejtekből, a preparálás során a nagyméretű bakteriális DNS kicsapódik, míg a kisméretű plazmid DNS oldatban marad, így elválaszthatók egymástól.
A mutáns klónokat szekvenáltatással (Biomi Kft. Gödöllő) ellenőriztem, majd a hibátlan mutáns részt PasI és AarI enzimek (Fermentas) segítségével, amelyek a flagellin génjét a D3 domént kódoló részen túl hasítják, átültettem a pKOT-1 (pBR322-fliC+flagellin saját promótere, ~8 kb) plazmidba, amit ugyanezzel a két enzimmel nyitottam fel. Erre azért
kifejeződő aminosavak egyrészt zavarnák a polimerizációt, így filamentumok nem építhetők belőlük, másrészt a mutagenezist minél kisebb bázisszámú vektoron érdemes véghezvinni az egyéb mutációk elkerülése érdekében. Újabb szekvenáltatást követően a jó klónokat elektroporációs technikával flagellintermelésre képtelen mutáns S. typhimurium SJW2536 baktériumokba juttattam.
Specifikus arzénkötő fehérjék számos mikroorganizmusban találhatók, ezek a fehérjék az arzén szervezetből való eltávolításában játszanak fontos szerepet. A bakteriális ArsR fehérje az arzén rendkívül erős (az arzént már jóval alacsonyabb koncentrációban köti, mint a környezetvédelmi határérték) és specifikus megkötésére képes. Térszerkezete ismert, az arzénkötő helyet három térbelileg egymáshoz közel elhelyezkedő cisztein oldallánc (thiol csoport) alakítja ki, a specifikus megkötéséért felelős polipeptidszegmens aminosavszekvencia a következő:
SerGlyGluLeuCysValCysAspLeuCysThrAlaLeuAspGln.
A rendelkezésre álló adatok szerint ez a szegmens erősen nyújtott konformációjú, végeinek távolsága közel 20Å, ezt kívántam a flagellin D3 doménjébe beépíteni. Számítógépes molekulamodellezés segítségével megállapítottuk, hogy a D3 domén Ala262-Thr273 öblös felületi hurokrégiója megfelelő vázként szolgálhat az arzénkötő motívum befogadására.
Ennek megfelelően az Ala262-Thr273 szegmenst a D3 doménből kivágtam, majd ennek helyére ültettem be az arzénkötő motívumot (16. ábra).
16. ábra: A flagellinmolekula a beépített As-kötő motívummal.
A Ni-kötő mutánsokhoz hasonlóan a korábban elkészített pGFP-FliC plazmidból kiindulva PCR segítségével olyan plazmidokat állítottam elő, ahol a FliC D3 doménjének
megfelelő szakaszai hiányoztak. A PCR során beépítettem egy KasI hasítóhelyet (GGC GCC/
Gly Ala), melynek segítségével összeligáltam a plazmidot. A felhasznált primerek a következők voltak:
Ala262 KasI helyre: 5¢ GCG GGC GCC AGC AAG AGT CAC CTC ACC
Thr273 KasI helyre: 5¢ GCG GGC GCC GCA ACT GAG GAT GTG AAA AAT GT Az esetleges mutációk elkerülése miatt hibajavító aktivitással rendelkező DNS polimeráz enzimet használtam, mint a mutagenezisnél (PfuTurbo polimeráz, Stratagene), és igyekeztem a ciklusszámot a lehető legalacsonyabb értéken tartani (18 ciklus). A megfelelő méretű PCR terméket (kb. 4800kb) gélből való izolálás után ligáltam. A ligálás 10 μl végtérfogaton történt 1μl T4 DNS ligázzal (New England Biolabs). A pGFP plazmid nagy kópiaszámú és nagy hatásfokkal transzformálja a CaCl2-dal kezelt kompetens TOP10 E. coli (Invitrogen) gazdasejteket. A rekombináns klónokat restrikciós térképezéssel ellenőriztem, a jó klónokból DNS-t preparálva templátként használtam a következő kísérleteim során.
Az As-kötő motívum beépítését többlépcsős PCR-rel végeztem. Első lépcsőben a fliC gént két darabban amplifikáltam átfedő primerek segítségével, majd ezt követően egy összeépítő PCR-t alkalmaztam. Az összeépítő PCR termékét templátként használva a KasI restrikciós helyeket tartalmazó oligók segítségével sokszoroztam az arzénkötő motívumot már tartalmazófliC gént.
A PCR reakciót optimalizáltam (hibridizációs hőmérséklet, ciklusszám) és a megfelelő méretű PCR termékeket gélből való izolálás és restrikciós emésztés után a pGFP vektorba ligáltam. A PCR termék vektorba ültetése után nyert klónokat szekvenáltatással ellenőriztem (Biomi Kft., Gödöllő), a jó klónokat elektroporációval szintén flagellintermelésre képtelen a mutánsS. typhimurium SJW2536 baktériumokba juttattam.