Ioncserélő és affinitás kromatográfia

Kromatográfia néven foglalhatók össze mindazok az elválasztás technikai módszerek, amelyekben két fázis közötti megoszlás eredményeként válik szét valamilyen elegy komponenseire. A két fázis közötti anyagátadás alapulhat adszorpción, ionos kölcsönhatáson, diffúzión, affinitás-kromatográfia esetén pedig különleges kölcsönhatásokon. Minden kromatográfiás eljárásnak közös vonása, hogy az egyik fázis folyamatosan áramlik a másik, ún. álló fázissal szemben. Az álló fázis halmazállapota lehet szilárd vagy folyadék, a mozgó fázis pedig folyadék vagy gáz. A folyadék mozgófázisú kromatográfiás módszereket a kivitelezés módjától függően feloszthatjuk oszlop és réteg kromatográfiás módszerekre.

A kromatográfiás módszereknek nagy jelenőségük van a biológiai eredetű molekulák elválasztása során. A fehérjék tisztítására töltésük (ami a közeg pH-jának változtatásával szabályozható) alapján, jól alkalmazható az ioncserélő kromatográfia. Affinitás

enzim-inhibitor, receptor-ligandum, antigén-antitest) használható fel úgy, hogy a specifikusan kölcsönható pár egyik komponense a szilárd fázishoz van rögzítve, és képes kikötni egy oldatból a kölcsönható partnert. Az oldat egyéb komponensei ezután mosással eltávolíthatók, majd a mozgó fázis paramétereinek változtatásával a specifikus kölcsönhatást megszűntetve az elválasztandó anyag tisztán lemosható az oszlopról.

A fehérjék ioncserélő kromatográfiával történő szétválasztása a molekulák felületi töltéseinek különbözőségén alapul. Az ioncserélő kromatográfia széles körben elterjedt a fehérjék tisztításánál, izolálásánál, ugyanis a mérsékelt kötő- és leoldási feltételek mellett sértetlen, biológiailag aktív fehérjék választhatók szét egymástól nagy hatásfokkal.

Az ioncserélő töltet kötött fázisa vagy pozitív (anioncserélő), vagy negatív töltésű (kationcserélő) funkciós-csoportokat tartalmaz. Az elektrosztatikus kölcsönhatás a különböző töltésű csoportok között a kromatográfiás töltet felszínén jön létre, ahol a kötőmolekulák viszonylag szorosan egymás mellett helyezkednek el. Az ionos kötés olyankor következik be, amikor a mozgó fázis ionerőssége egy bizonyos pont alá csökken, ilyenkor az oszlop töltetén levő töltött csoportokhoz hozzákötődnek az ellentétesen töltött molekulák. Az elúció akkor következik be, amikor a mozgó fázis ionerőssége elegendően nagyra nő, amit nagyobb ionkoncentrációjú oldattal érnek el (12.ábra). A sóionok a kötött molekulákkal helyet cserélnek, amelyek így visszakerülnek a mozgó fázisba [BIOMOLECULE CHROMATOGRAPHY

PERSEPTIVE BIOSYSTEM,1996].

A fehérjék töltéseit figyelembe véve az izoelektromos pont (pI) egy fontos tulajdonságuk, ami az a pH- érték, amelynél a negatív töltések száma megegyezik a pozitív töltésekével, vagyis amikor a nettó töltés egyenlő nullával. Ha egy molekula magas izoelektromos ponttal jellemezhető, akkor semleges pH mellett pozitív töltésűvé válik és az alacsony izoelektromos pontú pedig negatív töltésűvé.

12. ábra:Az ioncserélő oszlop működése.

Mivel a flagellinmolekula pI értéke 5,5, kísérleteimben a mutáns flagellinek tisztítását ioncserélő kromatográfiás rendszer (Biorad) segítségével végeztem XK16 (Pharmacia Biotech) 25 ml-es anioncserélő oszlopon, a minták beinjektálása automatikus mintaadagoló (Biorad) segítségével történt. Vivőpufferként 20mM-os Tris (A) puffert, elúciós pufferként 20 mM Tris 150mM NaCl (B) puffert alkalmaztam.

Az affinitás kromatográfia kiválóan alkalmas biomolekulák, többek között fehérjék, antitestek elválasztására (13. ábra). Az elválasztás alapja az állófázison megkötött ligandum, és a mozgófázisban lévő minta között létrejövő specifikus kötés. Az állófázison való rögzítéshez különböző technikákat alkalmaznak, mivel fontos, hogy a ligandum kellő távolságra legyen az állófázistól, ami biztosítja a ligandum jó hozzáférhetőségét a mintamolekula számára. Az állófázisra kötött ligandum változtatásával sokféle szelektív rendszert tudnak kialakítani. Így létrehozható egy olyan rendszer, amelyben az állófázis csak a számunkra fontos fehérjemolekulát köti meg. A specifikus elválasztáshoz fontos, hogy a hordozó ne kösse meg az oldatban lévő molekulákat. Ezért hordozónak olyan anyagokat használnak, amelyek hidrofóbok, és nincs ionos töltésük.

13. ábra:Kötési, és elúciós mechanizmus az affinitás kromatográfiában.

Munkám során megkötött fémet alkalmazó (IMAC) módszert használtam, itt a fémkelátképző csoport van rögzítve az állófázison (általában imido-diacetát), és ehhez koordinálódik a fémion (Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Co²⁺, vagy Fe²⁺) úgy, hogy egy, vagy több koordinációs hely alakul ki a fehérje számára. Az imidodiacetát a fémionokat három helyen köti meg, a többi koordinációs hely szabad marad az izolálandó molekula számára. Az elválasztás elve minden fémnél azonos ugyan, de a koordinációs hely geometriája és a kötés erőssége fémenként változik. Így a fémion hatással lesz az elválasztás szelektivitására. A kötéserősség alapján a következő sort állítható fel:

Cu²⁺>Ni²⁺>Zn²⁺~Co²⁺

Néhány, a fehérje felszínén elhelyezkedő aminosav különösen a hisztidin specifikusan kötődik a szabad koordinációs helyekhez. Így a hisztidinek számától függően elválaszthatók az egyes fehérje molekulák. Az elúció alapja bármely olyan folyamat, amely megszünteti a ligandum-ligandum kölcsönhatást, a legelterjedtebb az imidazol koncentráció gradiens alkalmazása. Az imidazol kötődik az állófázishoz, így leszorítja a molekulát onnan, annál később eluálódik egy molekula, minél erősebben koordinálódik az állófázishoz [BIOMOLECULE CHROMATOGRAPHYPERSEPTIVE BIOSYSTEM,1996].

Ezt a módszert használtam a D3 domén tisztításakor, ahol a D3 doménhez csatolt His6 -tag, egy 6 hisztidint tartalmazó peptidlánc a hatékony alapja az elválasztásnak. A munkához 5ml-es HisTrap HP (Amersham Pharmacia Biotech) oszlopot használtam, az állófázisra kötött fémion Ni²⁺ion volt, amit gyakran alkalmaznak His6-tages fehérjék tisztításakor. A felkötésnél alkalmazott puffer 20mM PB, 150mM NaCl pH=7.4 az elúciós puffer pedig növekvő (50, 100, 150, 200mM) imidazol koncentrációval 20mM PB, 150mM NaCl pH=7.4.