1. In Ni-binding proteins occuring in nature, the coordination of the Ni ions usually performed by imidazole groups of several (2-4) histidine side chains. By computerized graphics and molecular modeling I have established the variable D3 region of the flagellin to identify amino acids having side chains in suitable orientation and distance for constructing metal ion binding centre by replacing the relevant amino acids with histidine.
The proposed Ni-binding variants were constructed by site-directed mutagenesis.
Quantitative analysis of the Ni-binding ability of Leu209His-Val235His-Lys241His-Ser264His mutant was performed by isothermal titrating microcalorimetry. I have proved, that the dissociation constant of Ni-binding Kd= 5 μM and one Ni ion was bound to one flagellin subunit.
2. In the bacterial arsenic-binding protein (ArsR) can be found a polypetide segment specific binding of arsenic-ion. The amino acid sequence of As-binding motif is the next:
SerGlyGluLeuCysValCysAspLeuCysThrAlaLeuAspGln.
This segment has strongly streched conformation, distance of ends is close 20 Å. From size of this segment I have found it can be inserted into the Ala 262-Thr273 surface loop region of D3 domain. I have cut the Ala 262-Thr273 region from D3 domain, and I have inserted the As-binding motif by multi-steps PCR. The As-binding flagellin variant also showed an affinity for arsenite in the micromolar range.
3. Investigating the mechanism of filament formation, the hypothesis that the free N-terminal region of filament bind to the C-terminal region of the next subunit I have verified by fluorescence resonance energy transfer method. From examination of truncated flagellin’s polymerization I established that the observations are consistent with the coiled-coil model of filament formation, which suggests that the α-helical N- and C-terminal regions of axially adjacent subunits form an interlocking pattern of helical bundles upon polymerization.
4. Filamentous structure building Ni-binding variants was immobilized on surface of a sensor chip without dextran matrix and it was examined by SPR method. I have proved,
that the mutant filament have very high binding site density on their surface allowing trace level heavy metal ion analysis by optical methods.
5. I have cloned the gene segment encoding the D3 domain of flagellin. The structural stability of isolated D3 was characterized by differential scanning microcalorimetry, and proteolysis by trypsin. The experiments have revealed that isolated D3 has a stable tertiary structure which is highly resistant against proteolytic digestion. Its small size and stable structure makes D3 a promising protein scaffold for the development of artificial binding proteins.
KÖZLEMÉNYEK
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények
SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., VÉGH B.M., & VONDERVISZT, F. (2008).
The Hypervariable D3 Domain of Salmonella Flagellin Is an Autonomous Folding Unit.
Protein and Peptide Letters,15, 54-57.
SEBESTYÉN, A, VÉGH, B.M., SZEKRÉNYES, Á., KURUNCZI, S., VONDERVISZT, F. (2006).
Nehézfém-kötő flagellin alapú receptorok.Biokémia XXX/4.
GUGOLYA, Z., MUSKOTÁL, A.,SEBESTYÉN, A., DIÓSZEGHY, Z. & VONDERVISZT, F. (2003).
Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation.FEBS Letters,535,66-70.
Egyéb közlemények
MUSKOTÁL, A., KIRÁLY, R.,SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z.,VÉGH B.M. VONDERVISZT, F.
(2006). Interaction of FliS flagellar chaperone with flagellin. FEBS Letters, Vol. 580, 3916-3920.
FECZKÓ, T., MUSKOTÁL, A., GÁL, L., SZÉPVÖLGYI, J., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F.
Synthesis of Ni-Zn ferrite nanoparticles in radiofrequency thermal plasma reactor and their use for purification of histidine-tagged proteins, J. Nanoparticle Research, közlésre elfogadva.
Tudományos előadások, poszterek:
SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., GYIMESI, G., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.:
Ni- and As-binding flagellin-based receptors
KURUNCZI, S., NAGY, N., TÓTH, A. L., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.:
Immobilization of protein filaments on surfaces for optical sensing E-MRS (2007) Spring Meeting, Strasbourg (France).
PAP, A. E., KURUNCZI, S., SEBESTYÉN, A., TÓTH, A. L., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.:
Immobilization of protein segments into porous silicon for biosensor application E-MRS (2007) Spring Meeting, Strasbourg (France).
SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., SZEKRÉNYES, Á., GYIMESI, G., KURUNCZI, S., VONDERVISZT, F.: Nehézfém-kötő flagellin alapú receptorok Műszaki Kémiai Napok
’07 Veszprém, (2007).
SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., SZEKRÉNYES, Á., GYIMESI, G., KURUNCZI, S. ÉS
VONDERVISZT, F.: Nehézfém-kötő flagellin alapú receptorok Nanobiológia Miniszimpózium Pécs (2006). (Legjobb poszter díja).
SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., JAKAB, G., DIÓSZEGHY, Z., ZÁVODSZKY, P. &
VONDERVISZT, F.: The FliH component of the flagellar export apparatus is a multi-zinc enzyme with phospholipase activity. 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference. Budapest, Hungary (2005).
SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., JAKAB, G., MUSKOTÁL, A., DIÓSZEGHY, Z., ZÁVODSZKY, P., VONDERVISZT, F.: A flagellumspecifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással rendelkező multi-cink fehérje. A Magyar Biofizikai Társaság XXII. Kongresszusa. Debrecen, (2005).
KURUNCZI, S., TÓTH, A. L., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.:
Immobilization of protein filaments on surfaces for optical sensing. Hungarian Nanotechnolgy Symposium. Budapest, Hungary (2005).
MUSKOTÁL, A., KIRÁLY, R., SEBESTYÉN A., VÉGH B., VONDERVISZT F.: A flagellin-specifikus FliS dajkafehérje jellemzése. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 8. Munkaértekezlete. Tihany (2003).
MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, ELTE, OTDK Konferencia ( 2003).
Kémiai és Vegyipari Szekcióban, a biokémia-biotechnológia tagozatában III. helyezés.
MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., DIÓSZEGHY, Z., VONDERVISZT, F.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 7. Munkaértekezlete. Keszthely, (2002).
VONDERVISZT, F., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., DIÓSZEGHY Z.:
Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation.
XIV. International Biophysics Congress, Buenos Aires, Argentina (2002).
MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A., VONDERVISZT F.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. A Magyar Biofizikai Társaság Molekuláris Biofizika Szekciójának szegedi szekcióülése (2002).
MUSKOTÁL A.,SEBESTYÉN A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, VIII. Országos Felsőoktatási Környezettudományi Diákkonferencia, Veszprém (2002) Környezeti Kémia Szekcióban Környezetvédelmi és Vízügyi Minisztérium különdíja.
MUSKOTÁLA.,SEBESTYÉN A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, VE, TDK Konferencia (2001)
Kémiai és Vegyipari Szekcióban II. helyezés.
IRODALOMJEGYZÉK
AIZAWA, S.-I., VONDERVISZT, F., ISHIMA, R. & AKASAKA, K. (1990). Termini of Salmonella flagellin are disordered and become organized upon polymerization into flagellar filament.J. Mol. Biol.211, 673-677.
AMSTUTZ, P., FORRER, P., ZAHND, C., PLUCKTHUN, A., (2001). In vitro display technologies: novel developments and applications.Curr. Op. Biotech.12, 400-405.
AQUANAL NKFP PROJEKT: „Természetes vizek, földtani közegek helyszíni analízise mikro- és nano-érzékelési módszerekkel” (2005-2007).
ASAKURA, S. (1970). Polymerization of flagellin and polymorphism of flagella. Advan.
Biophys. (Japan)1, 99-155.
ASAKURA, S., EGUCHI, G. & IINO, T. (1964). Reconstitution of bacterial flagella in vitro. J.
Mol. Biol.10, 42-56.
BÁLINT M.,(2000) Molekuláris biológia I.; II. Műszaki könyvkiadó
BEATSON, S.A.,MINAMINO, T.,PALLEN, M.J.(2006). Variation in bacterail flagellin are disordered in solution. Trends Microbiol.14, 151-155
BLAIR, D.F. & BERG, H.C. (1990). The MotA protein of E. coli is a proton-conducting component of the flagellar motor. Cell60, 439-449.
BLOCKER A., KOMORIYA K., AIZAWA S-I (2003) Type III. secretion systems and bacterial flagella: insights into their function from structural similarities. Proc. Natl. Acad.
Sci.USA 100, 3021-3030
BUSENLEHNER, L. S., PENELLA, M. A., GIEDROC, D. P. (2003) The Smtb/ArsR family of metalloregulatory transcriptionalrepressors: structural insight into prokaryotic metal resistance.FEMS Microbiol. Rev.,27: 131–143.
DEAN, G.E., MACNAB, R.M., STADER, J., MATSUMURA, P. & BURKE, C. (1984). Gene sequence and predicted amino acid sequence of the MotA protein, a membrane-associated protein required for flagellar rotation in Eschericia coli. J.Bacteriol. 159, 991-999.
DEPAMPHILIS, M.L. & ADLER, J. (1971). Attachment of flagellar basal bodies to the cell envelope: specific attachment to the outer lipopolysaccharide membrane and the cytoplasmic membrane.J. Bacteriol.105, 396-407.
DRIKS, A. & DEROSIER, D.J. (1990). Additional structures associated with bacterial flagellar basal body. J. Mol. Biol. 211, 669-672.
FRANCIS, N.R., IRIKURA, V.M., YAMAGUCHI, S., DEROSIER, D.J. & MACNAB, R.M. (1992).
Localization of the Salmonella typhimurium flagellar switch protein FliG to the cytoplasmic M-ring face of the basal body.Proc. Natl. Acad. Sci. USA89, 6304-6308.
FRANCIS, N.R., SOSINSKY, G.E., THOMAS, D. & DEROSIER, D.J. (1994). Isolation, characterization and structure of bacterial flagellar motors containing the switch complex.J. Mol. Biol.235, 1261-1270.
GUGOLYA, Z., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., DIÓSZEGHY, Z., VONDERVISZT, F. (2003).
Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation.FEBS Letters535, 66-70
HIRANO, T., YAMAGUCHI, S., OOSAWA, K. & AIZAWA, S.-I. (1994). Roles of FliK and FlhB in determination of flagellar hook length in Salmonella typhimurium.J. Bacteriol.176, 5439-5449.
HOMMA, M., DEROSIER, D.J. & MACNAB, R.M. (1990). Flagellar hook and hook-associated proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components of the flagellum.J. Mol. Biol.213, 819-832.
IINO, T. (1969). Polarity of flagellar growth inSalmonella.J. Gen. Microbiol.56, 227-239.
JONES, C.J., MACNAB, R.M., OKINO, H. & AIZAWA, S.-I. (1990). Stoichiometric analysis of the flagellar hook-(basal-body) complex ofSalmonella typhimurium.J. Mol. Biol.212, 377-387.
JOYS, T.M. (1985). The covalent structure of the phase-1 flagellar filament protein of Salmonella typhimurium and its comparison with other flagellins. J. Biol. Chem. 260, 15758-15761.
KAGAWA, H., AIZAWA, S.-I., ASAKUA, S.(1979) Transformations in isolated polyhooks. J.
Mol. Biol.129, 333-336
KANTO, S., OKINO, H., AIZAWA, S.-I. & YAMAGUCHI, S. (1991). Amino acids responsible for flagellar shape are distributed in terminal regions of flagellin. J. Mol. Biol. 219, 471-480
KATO, S., OKAMOTO, M. & ASAKURA, S. (1984). Polymorphic transition of the flagellar polyhook fromEscherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 173, 463-476.
KHAN, I.M., REESE, T.S. & KHAN, S. (1992). The cytoplasmic component of the bacterial flagellar motor.Proc. Nat. Acad. Sci. USA89, 5956-5960.
MACNAB R.M. (2004) Type III flagellar protein export and flagellar assembly. BBA 1694, 107-217.
MACNAB, R. M. (1995) Flagella and motility. In: E. coli and Salmonella. Cellular and molecular biology. (Neidhart, F. C., Ed.) American Society for Microbiology, Washington D.C., USA pp.123–145.
METZGER, H. (1990). Fc receptors and the action of antibodies American Society of Microbiology.
MIMORI-KIYOSUE, Y., VONDERVISZT, F. & NAMBA, K. (1997). Locations of terminal segments of flagellin in the filament structure and their roles in polymerization and polymorphism.J. Mol. Biol.270, 222-237.
MUSKOTÁL, A., KIRÁLY R., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z.,VÉGH B.M. VONDERVISZT, F.
(2006). Interaction of FliS flagellar chaperone with flagellin. FEBS Letters,580, 3916-3920.
MYSZKA, D. G. (2000). Kinetic, equilibrium and thermodynamic analysis of macromolecular interactions with Biacore.Methods in Enzymology323, 325-339.
NAMBA, K. & VONDERVISZT, F. (1997). Molecular architecture of bacterial flagellum.
Quarterly Rev. of Biophysics30, 1, 1-65.
NAMBA, K., YAMASHITA, I. & VONDERVISZT, F. (1989). Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature (London)342, 648-654.
NYGREN, P. & UHLEN, M., (1997) Scaffolds for engineering novel binding sites in proteins.
Curr. Op. Struct. Biol7, 463-469
OHNISHI, K., OHTA, Y., AIZAWA, S.-I., MACNAB, R.M. & IINO, T. (1994). FlgD is a scaffolding protein needed for flagellar hook assembly in Salmonella typhimurium.J.
Bacteriol.176, 2272-2281.
PHARMACIABIOSENSORAB (1994). BIAtechnology Handbook (BR-1001-84).
ROMERO-ISART, N., VASÁK, M. (2002) Advances in the structure and chemistry of metallothioneins.J. Inorg. Chem.,88: 388–396.
SAIJO-HAMANO,Y., UCHIDA, N, NAMBA, K. (2004) In vitro characterization of FlgB, FlgC, FlgF, FlgG and FliE, flagellar basak body proteins of Salmonella J. Mol. Biol.339, 423-435
SAMATEY, F.A., IMADA, K., NAGASHIMA, S. (2001).Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoilingNature410, 331-337.
SCHOENHALS, G. & WHITEFIELD C. (1993). Comparative analysis of flagellin sequences from E. coli strains possessing serologically distinct flagellar filaments with a shared complex surface pattern.J. Bacteriol,175, (17), 5395
SHARP, L.L., ZHOU, J. & BLAIR, D.F. (1995). Tryptophan-scanning mutagenesis of MotB, an integral membrane protein essential for flagellar rotation in Eschericia coli.
Biochemistry34, 9166-9171.
SKERRA, A. (2001). Anticalins: a new class of engineered ligand-binding proteins with antibody-like properties.Rev. Mol. Biotech.74, 257-275
SOSINSKY, G.E., FRANCIS, N.R., DEROSIER, D.J., WALL, J.S., SIMON, M. & HEINFELD, J.
(1992). Mass determination and estimation of subunit stoichiometry of the bacterial hook-basal body flagellar complex of Salmonella typhimurium by scanning transmission electron microscopy.Proc. Natl. Acad. Sci. USA89, 4801-4805.
UENO, T., OOSAWA, K. & AIZAWA, S.-I. (1992). M ring, S ring and proximal rod of the flagellar basal body ofSalmonella typhimurium are composed of subunits of a single protein, FliF.J. Mol. Biol.227, 672-677.
URATANI, Y., ASAKURA, S., IMAHORI, K.,(1972). A circular dichroism study ofSalmonella flagellin: evidence of conformational change of polymerization J. Mol. Biol. 67, 85-98.
YOSHIOKA, K:, AIZAWA, S. I. & YAMAGUCHI S. (1995). Flagellar filament structure and cell motility of Salmonella typhimurium mutants lacking part of the outher domain of flagellin. J. Bacteriol.,177,(4), 1090-1093.
VAN DER MERWE, P. A. (2000). Surface Plasmon Resonance (Protein-Protein Interactions: A Practical Approach). Oxford University Press.
VÉGH,B.M., GÁL,P., DOBÓ, J., ZÁVODSZKY,P. & VONDERVISZT, F. (2006). Localization of the flagellim-specific secretion signal inSalmonella flagellin.Biochem. Biophys. Res.
Commun.345, 93-98.
VONDERVISZT, F., AIZAWA, S.-I. & NAMBA, K. (1991). Role of the disordered terminal regions of flagellin in filament formation and stability. J. Mol. Biol.221, 1461-1474.
VONDERVISZT, F., ISHIMA, R., AKASAKA, K. & AIZAWA, S.-I. (1992). Terminal disorder: a common structural feature of the axial proteins of bacterial flagellum. J. Mol. Biol.
226, 575-579.
VONDERVISZT, F., KANTO, S., AIZAWA, S.-I. & NAMBA, K. (1989). Terminal regions of
VONDERVISZT, F., UEDAIRA, H., KIDOKORO, S. & NAMBA, K. (1990). Structural organization of flagellin.J. Mol. Biol.214, 97-104.
WEAVER, R. F., HEDRICK P. W., (2000) Genetika Panem Könyvkiadó
WEI, L.-N. & JOYS, T.M. (1985). Covalent structure of three phase-1 flagellar filament proteins ofSalmonella.J. Mol. Biol.186, 791-803.
WILSON, D.R. & BEVERIDGE, T.J. (1993). Bacterial flagellar filaments and their component flagellins.Can. J. Microbiol.39, 451-474.
XU, L. (2002). Directed evolution of high-affinity antibody mimics using m-RNA display.
Chemistry& Biology9, 933-942
YAMASHITA, I., HASEGAWA, K., SUZUKI, H., (1998) Structure and switching of bacterial flagellar filament studied by X-ray fiber diffraction. Nature Struct. Biol.5, 125-132.
YAMASHITA, I., VONDERVISZT, F., MIMORI, Y., SUZUKI, H., OOSAWA, K. & NAMBA, K.
(1995). Radial mass analysis of the flagellar filament of Salmonella: implications for subunit folding.J. Mol. Biol.253, 547-558.
YONEKURA, K., MAKI-YONEKURA S. NAMBA, K., (2003). Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy Nature424, 643-650
ZHOU, J., FAZZIO, R.T. & BLAIR, D.F. (1995). Membrane topology of the MotA protein of Eschericia coli.J. Mol. Biol.251, 237-242.
ZHU, H. & SNYDER, M. (2003). Protein chip technology.Curr. Op. Chem. Biol.7, 55-63
KÖSZÖNET
KÖSZÖNETET MONDOK MINDAZOKNAK, AKIK A DOLGOZAT MEGÍRÁSÁHOZ SEGÍTSÉGET NYÚJTOTTAK.
Külön szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőmnek, Dr. Vonderviszt Ferencnek, aki már egyetemi éveim alatt betekintést engedett a “fehérjék világába”, egyengette szakmai pályafutásomat, és segítette munkámat.
Köszönettel tartozom a Pannon Egyetem Környezettudományok Doktori Iskola vezetőinek, Dr. Mészáros Ernőnek és Dr. Pósfai Mihálynak, hogy PhD tanulmányaimat a Doktori Iskolában végezhettem.
Köszönet illetiDr. Bársony Istvánt az MTA MFA igazgatóját aki lehetővé tette, hogy munkámat az ösztöndíjam lejárta után tovább folytathattam.
Köszönöm az MTA SZBK Enzimológiai Intézet igazgatójának, Dr. Závodszky Péternek, hogy kutatómunkám egy részét az intézetben végezhettem.
Szeretném megköszönni Dr. Gál Péternek azt a meghatározó nyári gyakorlatot, amely alatt megtanulhattam a molekuláris biológiai eljárások alapjait, és köszönöm Végh Barbarának is akitől sok segítséget kaptam a DNS-munkában. A számítógépes modellezésben nyújtott segítséget Gyimesi Gergelynek, Prettl Zsoltnak és Barna Lászónak köszönöm.
Köszönet illeti Szekrényes Ákost és Kurunczi Sándort a filamentumok felületi rögzítésének vizsgálataiért.
Köszönöm Muskotál Adélnak az együtt töltött “munkás” éveket, és azt a sokoldalú segítséget amit ezalatt tőle kaptam.
Munkám befejezését támogatta, ezért köszönettel tartozom a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítványnak.
Végül nagyon köszönömCsaládomnak,Szüleimnek, hogy hittek bennem, bíztattak és támogatták tanulmányaimat. És nagyon, de nagyon köszönömFérjemnek, hogy nap mint nap
mellettem állt és támogatott mindenben.
KÖSZÖNÖM!