PCR – polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)

A tudománytörténet úgy tartja, hogy a polimeráz láncreakció (PCR:

Polymerase Chain Reaction) elve 1983 áprilisában Kary Banks Mullis elméjében született meg. A módszer elvét, egy gyakorlati eredmény bemutatásán keresztül, 1985-ben közölték munkatársaival a Science magazinban (Saiki és mtsai, 1985). Ettől az időponttól a PCR által, egy egyszerű elven alapuló, de zseniális technikával bővült a molekuláris biológia eszköztára. Ez a ciklikus, in vitro, enzimkatalizált, DNS-szintetizáló eljárás lehetőséget teremtett arra, hogy kimutatható szintre növeljék a vizsgálni kívánt DNS-szakaszt, lényegében megszüntetve így a DNS vizsgálatok mennyiségi korlátait. Jelenleg az élettudományok szinte minden ágában alkalmazzák ezt a technikát. A PCR-rel kapcsolatos termékek, reagensek és készülékek hatalmas tárháza áll ma már rendelkezésünkre, s ma már egy PCR készülék megszokott alapfelszereltsége egy molekuláris biológiai laboratóriumnak.

3.1.3.2. A polimeráz láncreakció elve

Ez a forradalmian új technika tehát egy olyan in vitro (egyes speciális alkalmazásokban in situ) módszer, amelynek során meghatározott DNS szakaszokat lehet enzimatikus módon megsokszorozni (amplifikálás) két, az amplifikálandó szakaszt közrefogó, specifikus szekvenciájú oligonukleotid (primer) segítségével (Mullis és Faloona, 1987). A PCR elve a DNS függő DNS polimerázok aktivitásán alapul. Ezek az enzimek egy indító oligonukleotid, a primer segítségével képesek lemásolni, és így megkettőzni az eredeti DNS szálat. Ismételt működésük során az eredeti DNS molekula, a templát hatványozottan felsokszorozódik (Innis és mtsai, 1990). Emiatt kapta ez a módszer a polimeráz láncreakció elnevezést. Akár 10000 bp (bázispárban határozzák meg a DNS hosszát) DNS-szakasz is felsokszorosítható ezzel a módszerrel. A PCR technika létrejöttét egy termostabil DNS-polimeráz, a

Taq-polimeráz felfedezése és az automatizált fűtőblokkok (PCR készülék, thermocycler) kialakítása tette lehetővé, mivel a reakció általában 50-95°C-os hőmérsékleti tartományban zajló ciklikusan ismétlődő lépésekből áll (Brock és Freeze, 1969). Korábban a PCR-hez az E. coliból származó Klenow enzimet használták. Ekkor azonban forraláskor nemcsak a DNS, hanem az enzim is denaturálódik, ami azt jelenti, hogy a hőérzékeny polimeráz enzimeket minden ciklus után újra kell mérni a reakcióba. Az amerikai Yellowstone Nemzeti park forró vizű hőforrásában fedezték fel a Thermus acquaticus baktériumot (Brock és Freeze, 1969), amely 94°C-on él és a belőle kinyert DNS polimeráz, a Taq DNS polimeráz ezen a hőmérsékleten is megőrzi aktivitását.

Az exponenciálisan felsokszorozott DNS agaróz vagy poliakrilamid-gélen mutatható ki, interkalálódó DNS festék (etidium-bromid) segítségével (Righetti, 1989; Lindstedt és mtsai, 2000).

3.1.3.3. A PCR reakció menete

Az amplifikáció során a DNS-szintézis, majd a képződött termék denaturációjának ismétlődő ciklusai (25–40 ciklus) zajlanak. A PCR reakció rendkívül érzékeny, elméletileg alkalmas arra, hogy akár egyetlen DNS molekulát is felszaporítson, és ez által vizsgálhatóvá tegyen (Mullis és Faloona, 1987; Saiki és mtsai, 1985). A sokszorosítani kívánt DNS-szakasz bázissorrendjét, szekvenciáját nem feltétlenül szükséges teljes egészében ismernünk (egyes speciális esetektől eltekintve), általában a két végén elhelyezkedő 15-30 nukleiotid sorrendjét kell tudnunk, ahová a primerek bekötődnek. A primerek jelölik ki az amplifikálni kívánt DNS-szakaszt. A kettősszálú DNS szétválása, denaturációja után történik a primerek hibridizációja (anneálás). A primerek a denaturált, egyszálú templát DNS lánchoz H-hidak által kapcsolódnak a bázispárosodás elve szerint, azaz kizárólag adenin-timin (A-T), citozin-guanin (C-G) kapcsolatok jönnek létre. A primer utolsó nukleotidjában szereplő dezoxiribóz 3’ helyén egy szabad OH csoport található, amelyhez a DNS függő DNS-polimeráz kapcsolja a soron következő komplementer nukleotod 5’ foszfát csoportját. A polimerizáció a primer 3’ végén kezdődik és addig tart, amíg véget nem ér a templát, vagy míg a DNS polimeráz le nem válik a megszintetizált kettősszálú DNS darabról (Dieffenbach és mtsai, 1995). Adott hosszúságú DNS szakaszok

amplifikációjához legalább két primert használunk a PCR reakcióban, az egyik meghatározza a kierősítendő szekvencia elejét (forward primer), amely az úgynevezett sense DNS-szálhoz hibridizál, a másik pedig a végét (reverse primer), amely az antisense DNS-szálhoz kötődik a reakció során. Így a reakció végén csak a kívánt DNS-régió lesz jelen látható mennyiségben.

Ha mindkét primer szelektíven tapad a megfelelő egyszálú templát komplementer részéhez és az elongációk során az újonnan szintetizált DNS szálak túlnyúlnak az „ellenprimer” tapadási helyén, akkor ezen szálak is célszekvenciaként (template) fognak szolgálni, növelve a rendelkezésre álló templát mennyiségét ciklusról ciklusra. A primerekkel kiválasztott DNS régió mennyiségi növekedése a következő formulával fejezhető ki: N=(2ⁿ-2n)x, ahol

„n” a ciklusok száma, „x” a kiindulási templát mennyiség kópiáinak száma,

„N” az n ciklus után jelenlevő amplifikált DNS kópiáinak a száma (Rolfs és mtsai, 1992).

A PCR reakció egy ciklusa az alábbi három lépésből áll:

A PCR lépései:

A reakció egy ciklusa 3 eltérő hőmérsékleten lejátszódó, 3 különböző lépésből tevődik össze (2. ábra; Zsolnai, 2000). A reakció statisztikai folyamatként fogható fel, ezért pl. az annealing hőmérsékleten is lejátszódik elongáció és viszont.

- denaturáció: magas hőmérsékleten (92-96C-on) a két DNS szál elválik egymástól, lehetővé téve, hogy a primerek majd kapcsolódhassanak rájuk. A folyamat ideje: 30 sec.

- annealing (primerek kötődése): 50-70C-on a primerek kötődnek az egyszálúvá alakított DNS komplementer szakaszához. Az annealási hőmérséklet elsősorban a primerek olvadási hőmérsékletétől függ. A folyamat ideje: 30 sec.

- elongáció (lánchosszabítás): ebben a szakaszban játszódik le az új lánc szintézise a már láncindító szekvenciaként viselkedő primer tökéletesen

feltapadó 3’ végéről (72-73C-on). A lépés időigénye egyrészt függ magától a DNS-polimeráztól, másrészt az amplifikálandó DNS-szakasz hosszától.

2. ábra: A PCR-ciklus sematikus ábrája.

(1) Denaturálás 92-96 °C-on. (2) Kapcsolódás 50-70 °C-on. (3) Meghosszabbítás 72-73 °C-on (P=polimeráz). (4) Az első ciklus véget ért. Az eredményül kapott két DNS-szál a következő ciklus templátja lesz, azaz minden ciklusban megkétszereződik a DNS mennyisége.

(forrás: http://hu.wikipedia.org/wiki/K%C3%A9p:Pcr.png)

3.1.3.4. A PCR reakcióelegy összetevői

- Templát vagy target DNS: az a DNS, amelyről nagyszámú másolatot akarunk készíteni; biológiai mintából izolált DNS, amely lehet genomiális- vagy

mitokondriális DNS vagy RNS-ről reverz transzkripcióval átírt úgynevezett cDNS

- primerek: szintetikusan előállított DNS szálak (oligonukleotidok); a primer 1 (forward) az egyik DNS szálon komplementer és az amplifikálódó DNS kiindulását definiálja; a primer 2 (reverse) a másik DNS szálon komplementer és a termék végét határozza meg

- dNTP-k: az új komplementer lánc felépítéséhez szükséges alkotóelemek (d:

deoxy, N: adenin – citozin - guanin - timin, TP: tri-foszfát)

- Hőstabil polimeráz (pl.:Taq): a nukleotidok beépítését (lánchosszabítást) végző enzim

- Puffer: a hőstabil polimeráz megfelelő működéséhez biztosítja az ideális pH-t, ionerősséget és sókoncentrációt

- MgCl₂: a Taq polimeráz működéséhez nélkülözhetetlen; az optimális Mg²⁺

koncentráció általában 0,5-3 mM között mozog

- desztillált víz