Paraméterbecslés közelítéssel

Az egyszerűbb megközelítés a tisztán nyugalmi és tisztán inaktivált állapot közelítése olyan protokollok használatával, amelyek során a csatornák többsége nyugalmi illetve inaktivált állapotban van. A és értékek számolhatóak ekkor mind nyugalmi mind pedig inaktivált állapotokra egylépéses kötési folyamatot feltételezve.

109 6.2.2.1.1. Kísérletes protokoll

600 darab egymást követő depolarizációs pulzust alkalmaztunk, egy-egy pulzus során a membránpotenciál értékét -150mV-ról -20 mV-ra emeltük. Két egymást követő pulzus kezdetének időpontja között 55 ms telt el (vagyis a teljes protokoll 33 s hosszú volt). Öt különböző ilyen depolarizációs mintázatot alkalmaztunk, melyek az egyes pulzusok hosszában tértek el: 2.75 ms, 10.27 ms, 27.5 ms, 44.73 ms illetve 52.25 ms-nak választottuk a pulzusok hosszát, így a depolarizált membránpotenciálon eltöltött idő a teljes idő 5%-, 19%-, 50%-, 81%- illetve 95%-ának adódott. A depolarizációs időhosszakat úgy választottuk meg, hogy a depolarizált/hiperpolarizált időhosszak hányadosának eloszlása logaritmikus skálán egyenletes legyen (0.0526, 0.23, 1, 4.36, 19;

melyek logaritmusa -1.28, -0.64, 0, 0.64, 1.28).

A legrövidebb depolarizációkat alkalmazó sorozat esetében a csatornák többsége az idő legnagyobb részében nyugalmi állapotban van, ezért feltételeztük, hogy az ebben az esetben mért időállandók és az egyensúlyi gátlás értéke a nyugalmi állapotra jellemző értékeket közelíti. A leghosszabb depolarizációs pulzusok alkalmazásakor viszont az inaktivált állapot a meghatározó a csatornapopuláción belül, ezért ebben az esetben abból indultunk ki, hogy a mért időállandók, illetve az egyensúlyi gátlás értéke az inaktivált állapotra jellemző értéket közelíti.

A 200-dik pulzustól a 400-dik pulzusig, 11 s hosszan gátlószert adagoltunk és a gátlás kialakulását és kimosását vizsgáltuk. A felfutás és lecsengés időállandóját, valamint az egyensúlyi gátlás értékét mind az öt protokoll esetében a csúcsamplitúdók görbéiből határoztuk meg (lásd alább). A nyugalmi állapotra jellemző és értékeket ( ) a legrövidebb depolarizációt (2,75 ms) alkalmazó sorozatból, míg ugyanezeket az értékeket inaktivált állapotra ( ) a leghosszabb depolarizációt (52.25 ms) alkalmazó sorozatból határoztuk meg. Majd ezek hányadosából számoltuk és értékét az alábbiak szerint:

A számolás menete a következő fejezetben olvasható, valamint a 35. ábrán látható.

110 6.2.2.1.2. A és értékek számolása

Az asszociáció és disszociáció sebességi állandóit ( ) nyugalmi és inaktivált állapotra is az alábbi egyenletek segítségével számoltuk:

ahol a gátlószer koncentrációja. Láthatjuk, hogy a (41) egyenletrendszer túlhatározott, hiszen három mérhető értékünk van ( , és ) és csak két ismeretlen ( és ). Így a és értékét a három mérehtő érték közül bármelyik kettőből számolhatjuk ( és vagy és vagy és ). Amennyiben teljesül az

összefüggés, akkor mindhárom esetben azonos eredményt kapunk. Ha ez teljesül egy adott gátlószerre, akkor az állapotfüggésnek egy egylépéses kötési reakciót tartalmazó egyszerű modellje megfelelően leírja az adott gátlószer hatásmechanizmusát (36. ábra). Látni fogjuk, hogy az összefüggés nem fog teljesülni minden gátlószer esetében. Ilyen esetben bonyolultabb hatásmechanizmusra következtethetünk, melynek vizsgálatára a jelenleg tárgyalt megközelítés nem alkalmazható.

Másik módja annak, hogy kiderítsük, alkalmazható-e a közelítéses módszer az, hogy az értékeket számoljuk kétféle módon:

i.) az értékekből az egyszerűsített Hill-egyenlet segítségével, amikor is egy az egyhez (egy csatorna egy ligandumot köt) kötést feltételezünk (ahol Inh a gátolt áram relatív amplitúdóját jelöli ( , ha nincs gátlás és teljes gátlás esetén):

42 ii.) illetve a és értékekből:

Amennyiben mindkét esetben ugyanazt az értékeket kapjuk, a felfutás és a lecsengés sebessége megbízhatóan tükrözi a konformációs állapottól függő asszociációt és disszociációt. A 6.2.7. fejezetben látni fogjuk, hogy az 5 darab gátlószer közül 4 darab esetében ez volt a helyzet.

111 6.2.2.1.3. A közelítéses módszer előnyei és korlátai

A „közelítéses” módszer nagy előnye az egyszerűségében rejlik. Semmit sem feltételez a csatornakapuzás mechanizmusáról és az abban, a gyógyszermolekula bekötődésének hatására bekövetkező változásról. Így egy nem teljesen kielégítő modell sem vezet szükségszerűen helytelen következtetésekhez. Ugyanakkor viszont természeténél fogva pontatlan módszer három okból kifolyólag.

Egyrészt, nyilvánvalóan nem várhatunk pontos értékeket egy olyan módszertől, amely közelítésen alapszik.

Másrészt, ez a módszer figyelmen kívűl hagyja a kapuzás dinamikus változását, vagyis azt a tényt, hogy a gátlószer kötése megváltoztathatja a csatorna kapuzását. Pedig a valóságban számíthatunk arra, hogy ez szignifikáns szerepet tölt be a felfutás és lecsengés időállandójának kialakításában. Például a gátlószertől mentes és a gátlószert kötött csatornák ugyanannyi időt töltenek depolarizált versus hiperpolarizált állapotban adott protokoll esetében, az inaktivált versus nyugalmi állapotban töltött idejük azonban különbözni fog; a gátlószer kötése stabilizálhatja az inaktivált állapotot és így megnövelheti az inaktivált állapotban eltöltött idő hosszát. A felfutás során a csatornák kapuzása progresszíven változik a gátlószert kötött csatornák számának növekedésével.

Ennek a folyamatnak módosítania kell a felfutás időállandóját. A lecsengés folyamatára hasonló kölcsönhatást feltételezünk a kötődés és kapuzás között. A „közeltéses módszer”

nem tudja kezelni ezt a komplexitást.

Harmadrészt, a közelítéses módszer során a gyógyszermolekula kötőhelyhez való hozzáférését, illetve a kötés folyamtát egy egyszerű, egylépéses kötődési reakcióra egyszerűsítettük. Tudjuk azonban, hogy az asszociáció a nátriumcsatorna esetében többlépéses folyamat, mely magába foglalja a partícionálódás, deprotonálódás, intramembrán diffúzió, az ablakokon vagy az aktivációs kapun történő belépés, a belső üregben vagy az intracelluláris térben történő reprotonálódás és magát a kötődés folyamatát. A részfolyamatok közül néhány a ligandum-membrán kölcsönhatáson alapszik (mint a partícionálódás, vagy a protonálódás/deprotonálódás) így ezek függetlenek a konformációtól, míg más részfolyamatok (mint a bejutás és kijutás a fenesztrációkon keresztül, vagy a kötődés a belső üregben) a ligandum-fehérje kölcsönhatáson alapszanak és így állapotfüggőek.

112 Ez a közelítés tehát két feltétel mellett fogadható el:

i.) Az állapotfüggő asszociációs és disszociációs sebességek tárgyalásánál az

„asszociáció” és „disszociáció” fogalmának definíciójába bele kell foglalnunk azon szükséges lépések egész sorát, amelyek a csatorna konformációjától függenek:

belépés/kilépés az ablakokon keresztül és/vagy az aktivációs kapun keresztül, diffúzió a csatorna belső üregében és a kötődés/leválás folyamata.

ii.) Feltételeznünk kell, hogy az ilyen módon definiált „asszociáció” és „disszociáció”

sebességmeghatározó lépések. Természetesen lehetséges, hogy mind a ligandum-fehérje kölcsönhatás (konformáció-függő), mind pedig a ligandum-membrán kölcsönhatás (partícionálódás, deprotonálódás/protonálódás, melyek függetlenek a konformációs állapottól) a felfutás és lecsengés időállandójához szignifikánsan hozzájárul. Ilyen esetekben arra számítanánk, hogy a gátlás látszólagos állpotfüggését

„elfedheti” a lassú partícionálódás.

Megtudunk valamit az állapotfüggő felfutás/lecsengés kinetikájáról, ha az állapot-független részfolyamatok elhomályosítják eredményeinket? A szimulációk segítségével megvizsgáltuk (lásd 6.2.4. fejezet) a lassú partícionálódás hatását, hogy kiderítsük, ez elfedheti-e az állapotfüggő affinitást és akcesszibilitást.