A PNU-120596 vegyület állapotpreferenciájának vizsgálata

Első lépésként arra a kérdésre kerestük a választ, hogy rendelkezik-e a PNU-120596 vegyület állapotpreferenciával, vagyis létezik-e a receptornak olyan konformációja, amelyhez „szívesebben” köt a modulátor.

6.1.2.1. A PNU-120596 vegyület asszociációja a nyugalmi állapotú receptorhoz

A PNU-120596 vegyület nyugalmi állapotú receptorhoz történő asszociációját előkezelés segítségével tanulmányoztuk: az agonista perfúzióját a PNU-120596 vegyület növekvő hosszúságú perfúziója előzte meg.

Az áramokat 15, 215, 415, 615, 815, 1015 és 1215 ms előinkubációs idő után regisztráltuk (22. ábra). A legrövidebb (15 ms) előinkubáció esetében (technikai okok miatt nem tudtunk 0 ms-os előinkubációt alkalmazni) a második áramkomponens felfutásának időállandója 115,1 ± 41,1 ms-nak adódott (monoexponenciális illesztés;

tartomány: 30,6 – 286 ms). Hosszabb, 615 ms-os előinkubáció esetén a második áramkomponens felfutása felgyorsult és már nem volt illeszthető egyetlen exponenciális függvénnyel: egy gyors időállandó (10,7 ± 2,3 ms) jelent meg, ami az amplitúdók 54,9 ±

83

5,8% -áért volt felelős és a lassú időállandó is lecsökkent 53,3 ± 19 ms -ra (tartomány:

21,9 – 139 ms). Bár az áram felfutásának időállandói tekintetében az egyes sejtek közötti szórás jelentős volt, a gyorsulás egyértelműen megmutatkozott minden esetben és a lassú időállandó is szignifikánsan kisebbnek adódott (2,18 ± 0.38 – szoros különbség; p < 0,05, n = 5) 615 ms - os előinkubáció esetén, mint 15 ms előinkubáció esetén. Ennél hosszabb (80 s –ig vizsgáltuk) előinkubációs idők nem gyorsították tovább szignifikánsan a második áramkomponens felfutásást és nem csökkentették tovább szignifikánsan az első áramkomponens amplitúdóját. Mivel a felgyorsult lassú komponens időállandója kezdte megközelíteni a gyors komponensét (amely független volt a preinkubációtól), a két komponens kezdett egybeolvadni, de az első komponens gyors felfutása és különálló csúcsa ennek ellenére is mindvégig megmaradt.

22. ábra: 10 μM PNU-120596 vegyülettel történő előinkubáció nem csökkentette szignifikánsan az első áramkomponens amplitúdóját. A PNU-120596 vegyülettel történő különböző hosszúságú (15, 215, 415, 615, 815, 1015, 1215 ms) előinkubáció (kék) után 10 mM kolin és 10 μM PNU-120596 együttes perfúziója (fekete) által kiváltott áramok. A téglalapban az első áramkomponens nagyított képe látható.

A PNU-120596 vegyülettel történő előinkubáció során tehát a következőket figyeltük meg:

 a modulátor előinkubációja az első áramkomponenst lényegében változatlanul hagyta (a megfigyelt csökkenés mértéke nem volt szignifikáns: 9,4 ± 5%, n = 5),

 míg a második komponens felfutását szignifikánsan felgyorsította.

84

6.1.2.2. A PNU-120596 vegyület asszociációja a különböző deszenzitizált állapotokhoz Agonista jelenlétében a receptor nagyon gyorsan deszenzitizált állapotba kerül. A kísérleti adatok azonban arra utalnak, hogy a receptornak nem csupán egyetlen deszenzitizált állapota létezik (lásd 3.1.5. fejezet). Többen leírták ugyanis, hogy minél hosszabb az agonista-perfúzió, annál lassabb utána a deszenzitizációból való visszatérés [3], [4], [10], [38]. Ebből arra következtethetünk, hogy az α7nAChR több különböző

„mélységű” deszenzitizált állapottal rendelkezik.

Megvizsgáltuk, hogy a PNU-120596 vegyület azonos hatással van-e a különböző deszenzitizált állapotokra. Ebben az esetben az agonistával történt az előkezelés: 10 mM kolin változó hosszúságú perfúzióját 10 mM kolin és 10 μM PNU-120596 együttes perfúziója követte. Hosszabb előinkubáció esetén több receptor került lassú deszenzitizált állapotba. Azt vártuk, hogy amennyiben vagy a különböző deszenzitizált állapotokoz való affinitás vagy a receptoroknak ezekből az állapotokból való reaktiválásának hatékonysága eltérő, akkor a PNU-120596 vegyület hatása függeni fog a kolin-nal történő előkezelés hosszától.

A különböző hosszúságú (15, 95, 175, 335, 655, 1295, 2575 ms) kolin-nal történő perfúziót követő kolin és PNU-120596 együttes perfúziója során regisztrált jellemző görbék láthatóak az 23A. ábrán. Ahogyan a nagyított szakasz mutatja, az első gyors, kolin által kiváltott áramkomponens nem változott egyetlen regisztrátum esetében sem. Az egyre hosszabb kolin-nal történő előinkubáció azonban a receptorokat egyre érzéketlenebbé tette a PNU-120596 pozitív moduláló hatásával szemben (2.

áramkomponens). Az amplitúdók csökkenésének átlagát (23.B ábra; az amplitúdókat a csatornablokk hatásának kizárása érdekében a „rebound” áramkomponens (lásd 6.1.3.

fejezet) csúcsánál mértük) biexponenciális függvénnyel tudtuk illeszteni a következő időállandókkal: 353 ms (az amplitúdó 51%-ért volt felelős) és 2379 ms (az amplitúdó 49%-ért volt felelős). A PNU-120596 vegyülettel szemben érzéketlen deszenzitizált állapotok nemcsak az agonista jelenléltében, hanem az agonista és a modulátor együttes jelenlétében is kialakulhatnak [4]. Kísérleteinkben ez az első négy görbén (15-335 ms kolin perfúzió) volt megfigyelhető, ahol az áram egy maximális amplitúdó elérése után csökkenni kezdett (23.A ábra). Meg kell jegyezni azonban, hogy ez a konformációs állapot sokkal gyorsabban alakult ki akkor, amikor csak az agonista volt jelen. (Hasonlítsuk össze például az 1. és a 6. görbét kb. 2 másodperccel az agonista perfúziójának megkezdése előtt

85

(nyilak az 23.A ábrán)). A PNU folyamatos jelenlétében (1. görbe) az áram csak a maximumának 90%-áig csökkent le, míg 1295 ms-os kolin-kezelés és PNU távollét esetében (6. görbe) a „megmaradt” áram a maximum 37%-a volt.

23. ábra: A PNU-120596 vegyület moduláló hatása csökkent a kolin-nal történő előkezelés hosszának növelésével. A. 15, 95, 175, 335, 655, 1295 és 2575 ms kolin-nal történő előkezelést (zöld) az agonista és a modulátor együttes perfúziója (fekete) követett. A nagyított ábrán a kolin által kiváltott áram látható. A nyilak a PNU-120596 vegyület jelenlétében illetve távollétében megfigyelhető lassú deszenzitizáció összehasonlítását segítik. B. A 10mM kolin jelenlétében a PNU-120596 vegyülettel szembeni érzéketlenség kialakulásának időbeli lefutása. A pontokat dupla exponenciális függvénnyel tudtuk illeszteni.

Összegezve tehát a kísérletes eredmények azt sugallják, hogy a PNU-120596 vegyület főleg a gyors deszenzitizált állapotban lévő receptorokhoz asszociál. A mérésekből nem derült ki egyértelműen, hogy a modulátor a lassú deszenzitizált állapotú receptorhoz képes-e kötődni.

86