6. Eredmények
6.1. A PNU-120596 vegyület hatása a kolin által kiváltott áramokra
6.1.4. A PNU-120596 vegyület kolin által kiváltott áramokra gyakorolt hatásának
6.1.4.2. A PNU-120596 állapotpreferenciájának modellezése
A 6.1.2.1. fejezetben bemutatott kísérletekben a PNU-120596 vegyület állapotpreferenciáját vizsgáltuk és a következőket figyeltük meg:
a modulátor előinkubációja a bifázikus áram első komponensét lényegében változatlanul hagyta,
míg a második komponens felfutását szignifikánsan felgyorsította.
A modellezés gondolatmenetének és az eredményeknek a személeletesebbé tétele érdekében egyszerűsítsük a 25. ábrán látható sémát az agonista betöltöttségek összevonásával: a 27. ábrán látható kinetikai ábrákon az agonista-betöltöttség egyetlen szintjét ábrázoltuk (erre utal az „n” karakter, vagyis az öt ortosztérikus kötőhely közül n darab kötőhely kötött agonista molekulát, „p” jelzi a PNU-120596 molekulát kötött állapotokat). További egyszerűsítésként eltekintettünk a lassú deszenzitizált állapotoktól, valamint megengedtük az átalakulást a nyugalmi, nyitott és deszenzitizált állapotok között minden irányban.
27. ábra: A PNU-120596 vegyület α7nAChR-ra kifejtett hatásának kinetikai sémája. a.: Az α7nAChR három-állapotú modellje a PNU-120596 vegyületet kötött állapotokkal kiegészítve. b.: A PNU-120596 vegyület előinkubációját követő kolin és PNU-120596 együttes perfúziójának következtében történő állapotváltozások egy lehetséges útvonala. c.: A PNU-120596 vegyület előinkubációját követő kolin és PNU-120596 együttes perfúziójának következtében történő állapotváltozások valószínűsített útvonala. d.: A PNU-120596 vegyület hatásának minimális modellje. [139]
95
Gondolatmenetünk a következő volt: amennyiben lehetséges lenne a nyugalmi állapothoz (anR) történő asszociáció (27.b ábra), akkor a PNU-120596 vegyület perfúziója alatt a receptorok jelentős része modulátort kötne és így a panR állapotba kerülne. Ha a receptorok a panR állapotban vannak, akkor a modulátor-mentes receptorok agonsita által kiváltott gyors aktivációja (átmenet anR - ből anO - ba) nem lehetséges, mert az áram felfutásának sebességét a kapuzás sebességi állandói határozzák meg, melyeket drasztikusan lelassít a modulátor kötődése. Így amennyiben a receptorok jelentős része panR állapotban lenne, az áram első gyors komponensének szignifikánsan csökkennie kellene. A PNU-120596 vegyülettel történő előinkubációs kíséreletek során azonban ennek éppen az ellenkezőjét figyeltük meg: a gyors komponens minimális csökkenést mutatott.
A modell segítségével megvizsgáltuk, hogyan viselkednének a receptorok abban az esetben, ha a modulátor affinitása nem lenne érzékeny a receptor konformációjára (28.
ábra, 3. Táblázat; „A” paraméterhalmaz). Ennek során lehetővé tettük a modellben a nyugalmi állapotú receptorhoz való asszociációt is és ahogyan vártuk, előinkubáció hatására a kísérletes eredményekkel (22. ábrán látható áramok) ellentétben az első áramkomponens kezdett eltűnni (28. ábra felső panel).
3. Táblázat.: Az allosztérikus faktorok és szimmetrikus gátfaktorok értékei az „A”-„D”
paraméterhalmazokban. A Q allosztérikus faktor a modulátor-kötés és a receptor deszenzitizációja közötti kapcsolatot számszerűsíti. Q < 1 esetén a modulátort kötött receptorok a deszenzitizált állapotot preferálják, és a modulátor affinitása a deszenzitizált állapotú receptorhoz nagyobb. Az M allosztérikus faktor az agonista és modulátor közötti kooperativitást jellemzi. M > 1 értékek azt jelentik, hogy az egyik ligandum bekötődése növeli a másik kötőhely affinitását. Az xRDS < 1 szimmetrikus gátfaktor a modulátort-kötött receptorok (minden konformáció) esetében emelkedett energiagátat jelent az x tengely mentén, vagyis egyenlő mértékben csökkenti az asszociáció és disszociáció folyamatát. Paraméterhalmazok: A: alap modell:
a modulátor nincs hatással a nyugalmi-deszenzitizált equilibriumra; nincs kooperativitás az agonista és modulátor kötőhelyek között; sem az agonista, sem pedig a modulátor asszociációja nem gátolt. B: A modulátor a deszenzitizált állapotot részesíti előnyben. C: Magasabb kooperativitás és az agonista kötőhelynek mérsékelten gátolt akcesszibilitása. D: Mérsékelt kooperativitás és az agonista kötőhelyének erősen gátolt akcesszibilitása. [139]
96
28. ábra: A szimulációkban kapott áramok különböző paraméterektől való függése. A szimulációs görbék az összes nyitott állapot betöltöttségét mutatják az idő függvényében (A,B,D). (Itt a kísérletes regisztrátumokhoz képest fordítva látjuk a görbéket, negatív) A: a PNU-120596 asszociációja a nyugalmi állapotú receptorhoz. A görbék mindkét paraméterhalmaz esetében a szimulált áramok 10 μM PNU-120596 vegyületnek 15, 215, 415, és 615 ms hosszú pre-inkubációját követő kezdeti szakaszát mutatják. A felső panel az „A” paraméterhalmazzal (egyforma asszociációs sebesség a nyugalmi és a deszenzitizált állapotú receptorhoz, lásd 1. táblázat), az alsó a „B” paraméterhalmazzal (csökkentett asszociációs sebesség a nyugalmi állapotú receptorhoz, melyet a modulátor-kötés által előidézett deszenzitizált állapot perferenciája ellensúlyoz) végzett szimulációk eredményét mutatja. B: A kolin disszociációja a modulátort kötött receptorokról. A görbék 3 paraméterhalmazzal szimulált, a kolin és PNU-120596 1 s hosszú együttes adagolása, majd 2 s hosszú PNU-120596 adagolása által kiváltott áramokat mutatja (lásd 2. Táblázat). C:
Koncentráció-relatív amplitúdó (teli szimbólumok) és koncentráció-relatív nettó töltés (üres szimbólumok) görbék 10 μM PNU-120596 jelenlétében két paraméterhalmaz esetében. A modulátor-mentes, agonista által kiváltott áramok szürke színben láthatóak. A vastag vonalak az adatpontokra illesztett Hill-egyenletek görbéi. D: A 10 mM kolin által szimulációban kiváltott áram első másodperce, amikor a modell viselkedését több többféle fiziológiás körülmény között vizsgáltuk: rövid (10ms) agonista-pulzusok alacsony koncentrációjú (1 μM) PNU-120596 folyamatos jelenlétében. [139]
97
A mérések során kapott eredmények reprodukálását a nyugalmi állapothoz való affinitás módosításával kíséreltük meg. Ezt a „Q” faktor változtatásával értük el (25. ábra), melynek csökkentése lelassítja a modulátor asszociációját, miközben a disszociációját nem befolyásolja és mindezt „kiegyensúlyozza” a modulátort-kötött deszenzitizáció elősegítése. Ahhoz, hogy az első áramkomponens csak olyan minimális mértékben csökkenjen, mint a kísérletekben (9,4%), a „Q” faktort legalább 0.15-re kellett csökkentenünk („B” paraméterhalmaz), ami azt jelenti, hogy a nyugalmi konformációhoz való asszociáció legalább 44,4-szer lassabb kellett legyen a deszenzitizált konformációhoz való asszociációnál (28A. ábra alsó panel). Mindebből arra a következtetésre jutottunk, hogy a PNU-120596 a nyugalmi állapotú receptorhoz elhanyagolható mértékben asszociál.
Felmerül a kérdés, hogy milyen folyamat állhat a második áramkomponens felgyorsulásának hátterében, ha feltételezzük, hogy az nem a PNU-120596 vegyület kötőhelyhez való asszociációjának következménye. Tudjuk, hogy a PNU-120596 vegyület kötőhelye a receptor transzmembrán régiójában található, illetve azt is, hogy a molekula lipofil (számolt LogP értéke 2,57). Úgy gondoljuk, hogy a modulátor a kötőhelyét talán a membrán fázisból éri el, és a membránba való partícionálódása, illetve az ott történő felhalmozódása lehet az a folyamat, amely néhány száz milliszekundomot vesz igénybe.
Ha a partícionálódás equilibriumát sikerült elérni, és a membrán fázis telítődött, akkor a kötődés gyorsabban történhet meg és így a PNU-120596 pozitív moduláló hatása is gyorsabban jelenik meg, ezáltal pedig az áram felfutása felgyorsul. Modellünkben a vizes közeg és az intramembrán tér PNU-120596 koncentráció-változásának ( , ) dinamikáját a következő differenciálegyenlet segítségével írtuk le:
ahol és a megfelelő partícionálódási sebességi állandókat jelölik. A PNU-120596 vegyület vizes oldat és membránfázis közti megoszlási hányadosát nem ismerjük, a partícionálódási és megoszlási hányadosok becsült értéke (LogP, LogD) csak a víz-oktanol megoszlásra ismert, amely nagyon különbözhet a membrán és vizes közeg közötti megoszlástól. A membrán-vizes oldat megoszlási hányadost 1-nek választottuk (10-szeres felhalmozódást feltételezve).
98
A szimulációk segítségével megmutattuk, hogy PNU-120596 vegyülettel történő előinkubáció esetén a modulátor molekula membránfázisba történő partícionálódása felelős lehet az áram felfutásának ilyen mértékű felgyorsításáért.
Összegezve eredményeinket, úgy gondoljuk, hogy a nyugalmi állapothoz történő asszociáció elhanyagolható, és így a PNU-120596 vegyületet kötött nyugalmi állapot (panR) betöltöttsége is. Ez a következtetés, valamint az 1.c séma előnyben részesítése [140]
cikk 4. sémájával szemben az 27.d sémán látható topológiához vezet.