A közelítéses módszer és a modellezés folyamata

A kísérletes adatokat mindkét módszerrel (közelítés, modellezés) kielemeztük. Az analízis folyamata a 35. ábrán látható. A vizsgált sejtek száma minden gátlószer esetén (300 μM lidocaine, 100 μM bupivacaine, 300 μM phenytoin, 100 μM riluzole, 100 μM flecainide) 5 és 7 között volt. Minden sejt esetében a gátlószer adagolását ötször ismételtük meg, minden feszültségprotokoll esetében egy alkalommal: a protokollok 600 darab depolarizációból álltak, a gátlószert a 200-adiktól a 400-adikig perfundáltuk. A kiváltott áramok csúcs amplitúdóit az idő függvényében ábrázoltuk (35. ábra, 1. lépés). Az öt különböző szürke árnyalattal jelölt görbe az öt különböző depolarizációs hosszat jelöli:

2.75, 10.27, 27.5, 44.73, 52.25 ms a feketétől a világos szürkéig (ilyen sorrendben). Az amplitudó-görbéket normalizáltuk a 190. – 199. depolarizációk csúcs amplitúdóinak átlagához, majd a felfutási és lecsengési fázisokat exponenciális függvénnyel illesztettük (35. ábra, 2. lépés). Az öt különböző görbéből kapott , és értékeket a depolarizált/hiperpolarizált időhosszarány függvényében ábrázoltuk (35. ábra, 3. lépés, vékony vonalak). Ezekből kiszámoltuk az átlagértékeket: az időállandók esetében a mértani közepet, a gátlás mértékének esetében a számtani közepet (35. ábra, 3. lépés, vastag vonalak). Mind az öt protokollra kiszámoltuk azA és D értékeket kétféle képpen:

az Inh és onset (ld. 35. ábra, 3. lépés, kék vonallal keretezett táblázat, ill. 36.E ábra), illetve az Inh és offset értékekből (ld. 35. ábra, 3. lépés, kék szaggatott vonallal keretezett táblázat, ill. 36. E ábra). Az átlagos Inh és onset értékekből (sötétkék rombusz) ill. Inh és

offset értékekből (világoskék rombusz) számolt A - D párokat szintén a 36.E ábrán mutatjuk. Ezeknél a számolásoknál a közelítéses módszert alkalmaztuk, vagyis csak a két szélső értékkel számoltunk (piros keret a 35. ábra 3. lépés táblázatában), hiszen ezek felelnek meg a főként nyugalmi, illetve főként inaktivált állapotú csatornákat tartalmazó populációknak. A és értékeket nyugalmi és inaktivált állapotra a (41) egyenletek alapján számoltuk a 2.75 és 52.25 ms hosszú depolarizációs lépések alkalmazásával kapott görbékből (ilyen sorrendben). (A ill. értékek hányadosa adja meg az ill.

értékeket.) Amennyiben a két különböző módon számolt A és D értékek, illetve a két különböző módon számolt látszólagos affinitás értékek hasonlóak egymáshoz, elkönyvelhetjük, hogy ez az egyszerű modell elfogadhatóan leírja a gátlószer működését, és a közelítéses módszer tudja kezelni a problémát. Ha nem így van, akkor komplexebb

124

hatásmechanizmussal van dolgunk, és más módszert kell választanunk, amivel megpróbáljuk azt megfejteni.

Ezután a modellezés segítségével próbáltuk megérteni az adott gátlószer hatásmechanizmusát. A paraméter-optimalizációhoz nem használhattuk az eredeti kísérletek eredményeit, mert azok jelentős szórást mutattak. A görbék átlagát nem vehettük, mert ez összemosta volna az egyedi sejtek különböző protokollokra adott válaszainak különbségét a sejtek közötti különbségekkel, és torzította volna az időállandók értékét. Ehelyett idealizált kísérletes görbéket (35. ábra, 4. lépés, kék görbék) készítettünk a következő módon: a felfutás kezdetétől a lecsengés kezdetéig az exponenciális lecsengést a mértani közepének és az (1- ) számtani közepének felhasználásával ábrázoltuk. A lecsengés kezdetétől a negatív exponenciális lecsengést a és az (1- ) értékek átlagából számoltuk. A lecsengés kezdete előtt az értéket „1”-nek választottuk. Minden gátlószerhez öt idealizált görbét készítettünk (minden protokollra egyet).

A paraméteroptimalizáció során a Berkely Madonna szoftver beépített algoritmusát és egy, a Mathematica programban sajátkezűleg készített függvényt használtunk. Az ötféle depolarizációs hosszhoz tartozó öt darab görbe paramétereit egyszerre illesztettük. Az optimalizációt mindig a legegyszerűbb lehetséges mechanizmusnak megfelelő modellel kezdtük. Ekkor teljesült, és csak az , és értékeket becsültük. Csak abban az esetben indultunk el bonyolultabb mechanizmusok irányába, amikor ezzel a modellel nem tudtuk megfelelően illeszteni az idealizált görbéket. Ekkor már értékét is szabad paraméterként kezeltük. Ha még így sem sikerült a kísérletes adatokat (idealizált görbéket) elfogadhatóan reprodukálni, akkor -t és végül -t is szabad paraméterként kezeltük.

A legjobb, szimuláció során kapott illesztéseket (35. ábra, 4. lépés, piros görbék) a 36.C ábra mutatja minden egyes vegyületre. Az öt gátlószerből kettő (phenytoin, riluzole) esetében még így sem jutottunk megfelelő illesztésekhez, ezért változtatnunk kellett a modell topológiáján. Első próbálkozásként megpróbáltuk a különböző mélységű lassú inaktivált állapotok kialakulásával megmagyarázni a jellegzetes gátlási mintázatokat, ezért ezeket az állapotokat is beépítettük a modellbe. A kiegészített mokellekkel nem (riluzole), vagy csak nagyon valószínűtlen paramétereket bevezetve (phenytoin) tudtuk a mintázatokat reprodukálni. Egy másik megközelítéssel két külön kötőhelyet feltételeztünk, és építettünk be a modellekbe. Ezzel a kiegészített modellel mindkét vegyület gátlási mintázatát meglepően jól sikerült reprodukálni (lásd 6.2.2.2.3, 6.2.2.2.4 fejezetek).

125

126

Az optimalizálás során kapott paraméterekből az A és D értékek számolhatók (35.

ábra, 4. lépés, piros keret), és – ellentétben a közelítéses módszerrel – ezek az értékek valóban a nyugalmi illetve inaktivált állapotra jellemző értékek, nem torzítja őket sem a nyitott állapotban, sem pedig a másik állapotban töltött idő (amely, mint láttuk, a teljes idő mintegy 1/19-e). Az értékeket a 36.E ábrán piros rombuszokkal jelöltük. Az A - D térképen a modell optimalizációjával kapott érték összevethető a kísérletes (közelítésen alapuló) értékekkel.

Ahhoz, hogy a modell elfogadhatóságát meg tudjuk ítélni, szükséges, hogy a szimulációk által produkált Inh, onset és offset értékeket össze tudjuk vetni a kísérletekben kapott hasonló értékkel. Ehhez a szimulált görbéket is illeszteni kellett exponenciális függvényekkel (35. ábra, 5. lépés, zöld görbék). Az eredményül kapott , és

értékek a 36.D ábrán láthatóak (piros vonalak). A 35. ábrán látható esetben (100 μM bupivacaine) az optimalizáció során kapott mechanizmus elfogadhatóan pontos illesztését adta a kísérletes adatoknak. Ez azt mutatja, hogy a szóbanforgó mechanizmus lehetséges, de nem jelenti azt, hogy ez a vegyület valódi hatásmechanizmusa. Másrészt viszont, amennyiben nem sikerül a kíséletes adatokat megfelelően reprodukálni, valószínűsíthető, hogy a vegyület az adott mechanizmusnál bonyolultabb módon fejti ki hatását (lásd következő fejezet).