Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése

A kapilláris elektroforézis módszerfejlesztés, biológiai mintákból származó nagyszámú peptid analízisére és azonosítására, bonyolult és időigényes feladat. Megfelelő matematikai modell alkalmazásával az ehhez szükséges hosszú idő lerövidíthető, ugyanakkor javítható az elválasztás hatékonysága és felbontása¹⁰². Egy ilyen munka első lépése a matematikai modell kidolgozása a minták elektroforetikus viselkedésének előrejelzésére. Kapilláris elektroforézis esetén alapvető az elektroforetikus mobilitás előrejelzésére a mennyiségi szerkezet -tulajdonság összefüggés (QSPR: quantitative structure-property relationship) ismerete, ami megkönnyíti az elválasztás hosszú és fárasztó kísérleti optimalizálását. A QSPR vizsgálatoknál matematikai összefüggéseket keresnek valamely tulajdonság (mint például az elektroforetikus mobilitás) és egy vagy több szerkezeti jellemző (structural descriptor; mint például töltés vagy méret) közt abból a célból, hogy leírják, miként határozzák meg e szerkezeti jellemzők az adott tulajdonságot. A fő nehézség, amely ezzel a megközelítéssel jelentkezik, az alkalmas modellezési módszer kiválasztása és a molekuláris szerkezet leírása a megfelelő molekuláris jellemzőkkel¹⁰³.

Kapilláris elektroforézis alapú peptidelválasztások esetén kézenfekvőnek tűnik az elektroforetikus mobilitás becslése olyan molekuláris jellemzőkből, mint az elsődleges szerkezet (primary structure). Korábban számos olyan elméleti prediktív modellt dolgoztak ki, melyek a peptidek fizikai-kémiai tulajdonságaival teremtenek közvetlen kapcsolatot¹⁰⁴. Ezek a modellek mind levezethetők Stokes törvényéből (Stokes’ law), és jellemzőjük, hogy az elektroforetikus mobilitás a Q R/ hányadossal áll kapcsolatban, ahol Q a peptid töltése, R pedig a Stokes-féle rádiusza^105-106. Az összefüggést a peptidek effektív mobilitása és valódi töltésük (actual charge), méretük (relatív molekulatömeggel megadva) és alakjuk közt először Offord írta le 1966-ban^105-106. További prediktív modelleket dolgoztak ki Grossman és munkatársai 1989-ben ¹⁰⁷, Compton 1991-ben¹⁰⁸, valamint Cifuentes és Poppe 1994-ben¹⁰².

A fent említett modellek többsége a töltést (Q) az aminosavak ionizálható csoportjainak disszociációs állandóiból számítja, és R a peptidek molekulatömegével (^M ) függ össze.

Azok a megfontolások, hogy a peptidek mobilitásának változását kizárólag két molekuláris jellemző – a töltés és a méret – alapján vizsgálják, némi következetlenségre, ellentmondásra vezetnek az irodalomban. A töltésszámítás alapvetően a Henderson-Hasselbach egyenlet

alapján történik, azonban ez bizonyos hatásokat – mint az elektrosztatikus töltésszupresszió vagy a töltéseloszlás – csak részben vagy egyáltalán nem vesz számításba. A fő különbség az említett modellek közt, az R és M kapcsolatának eltérő jellemzéséből adódik¹⁰⁹. Ezek a modellek mind szemi-empirikus alapúak, változó kísérleti körülményekkel (diverz peptidméret, töltéseloszlás, háttér elektrolit ionerősség)¹¹⁰. Ebből a részben empirikus megközelítésből adódóan, e modellek alkalmazási területe elméletileg is korlátozott, a korreláció megalkotásához alkalmazott kísérleti peptidekhez való hasonlóság és a modellhez használt puffer rendszer alapján, ami megakadályozza, hogy általánosan elfogadhatónak tekinthessük őket¹¹¹.

Xin és munkatársai nemrégiben egy érdekes, az empirikus alaptól eltávolodó módszert mutattak be¹¹². Egy az elektro-hidrodinamikus elméleten alapuló, ezért kísérleti mérésektől független, „gyöngy modell”-t (bead-model) alkottak gyengén töltött peptidek vizsgálatára.

Összefoglalva megállapítható, hogy az Offord-modellel gyakran sikerült kielégítő korrelációt elérni106,113-117

. Azonban az Offord-modell legnagyobb hiányossága, hogy a peptideknek mindössze két fizikai-kémiai tulajdonságát veszi figyelembe, nevezetesen a töltésüket és relatív molekulatömegüket. A peptidek elektroforetikus mobilitása minden bizonnyal nem jósolható kellő pontossággal minden peptid kategóriában QSPR modellekkel, kizárólag Q és M jellemzők alapján^116,118.

A kétváltozós szemi-empirikus QSPR modellek e problémájának leküzdésére alapvetően két stratégiát alkalmaznak. Egyrészt újabb releváns paramétereket vezettek be a QSPR modellbe^115-116, másrészt nem-lineáris modellezési módszerekkel próbálkoztak, mint a mesterséges neurális hálózatok (ANN: artificial neural network), abból a célból, hogy pontosabb és robosztusabb modelleket kapjanak103,114,118-120

. Az ANN sikeres alkalmazása QSPR modellek kidolgozására igazolni látszik a feltételezett nem-lineáris összefüggést a peptidek jellemzői és elektroforetikus mobilitása között.

1.3.1 Szemi-empirikus modellek

Bár a többváltozós modellek (1.3.2 fejezet) egy része is szemi-empirikusnak tekinthető, ebben a fejezetben kizárólag a kétváltozós szemi-empirikus modellek kerülnek bemutatásra.

Az összefüggést a peptidek effektív elektroforetikus mobilitása (µ_ef ) és tényleges töltésük, relatív molekulatömeggel kifejezett méretük és a peptidlánc alakja (konformációja) közt jó ideje vizsgálják¹⁰⁵. Egy töltött részecske elektroforetikus mobilitása Stokes törvénye alapján a következőképpen adható meg:

Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése

ef 6 Q µ R

= πη (1)

ahol ηa közeg dinamikai viszkozitása.

Offord próbálkozott elsőként kisméretű peptidekre alkalmazható fundamentális elekroforetikus modell megalkotásával. A modellezés során a peptideket tömör, gömbszerű részecskéknek tételezte fel¹⁰⁶. Modellje az elektroforetikus mobilitás és a peptidek molekulatömege közt teremtett összefüggést, feltételezve, hogy az elektroforézis során a peptid molekula gömbszerű, állandó sűrűségű testként viselkedik. Ezért sugara V¹³ – következésképpen M¹³ – értékével arányos (ahol V a molekula térfogata, M pedig a tömege). Stokes törvényének megfelelően a peptidre ható súrlódási erő arányos ^R értékével, és így szükségszerűen ^M¹³ értékével is arányosnak kell lennie¹¹⁰. Első közelítésként a moláris tömeget (M) a molekuláris térfogattal (4 ³)

3πR arányosnak tekintve az elektroforetikus mobilitás a következőképpen fejezhető ki:

13 ef

k Q M

µ = (2)

ahol k egy, kísérleti körülményektől függő, empirikus állandó.

Offord feltételezte továbbá, hogy az elektroforézis során migráló peptidre ható súrlódási erő az ellentétes töltésű, ionos hidrát-burkának köszönhető, mely az oldószer ellenáramát okozza a migráló molekula közvetlen környezetében¹⁰⁶. Más szavakkal, a visszatartó erő a molekula környezetében a folyadékréteg kis elemei közt fellépő nyírás eredménye. Így ez az erő a molekula felszínének (R²) függvénye, és ezért M²³ értékével arányos¹¹⁰. Offord papír zóna elektroforetikus peptidelválasztások alapján az elektroforetikus mobilitás leírására a következő összefüggést vezette le:

23 ef

k Q M

µ = (3)

Ezzel szemben a szintetikus polimerek vizsgálatai¹²¹ azt mutatták, hogy egy polimer forgási sugara (radius of gyration) a monomer egységek számának négyzetgyökével arányos megszorozva a monomeregység hosszával. Így a súrlódási erő ^M¹² értékével adódik arányosnak:

12 ef

k Q M

µ = (4)

Egy, a polimerek szemi-empirikus modelljével analóg egyenletet mutattak be Kim et al., akik enzimatikus fehérje emésztményekből nyert peptideket vizsgáltak¹²²:

ef 0,56

k Q

µ = M (5)

Stokes és Offord-modelljeit Compton egyesítette, javasolva a mobilitás molekulatömeg-függésének ₁

közötti folytonos függvénnyel való megadását, a protein molekulatömegének és az elektrolit ionerősségének függvényében¹⁰⁸:

1 1 2

Grossman és munkatársai az oldatban a peptideket klasszikus lineáris polimereknek tekintve, méretüket az aminosavak számával ( )n kifejezve alkották meg szemi-empirikus modelljüket¹⁰⁷. Logaritmikus töltésfüggést alkalmaztak, hogy a töltött csoportok elektrosztatikus kölcsönhatásait kompenzálják, ami különösen erősen töltött peptidek esetén bír megnövekedett jelentőséggel^107,113. A következő összefüggést vezették le az effektív mobilitás töltés- és méretfüggésének leírására:

( )

Cifuentes és Poppe Grossman klasszikus lineáris modelljét fejlesztették tovább¹⁰². Megtartották a logaritmikus töltésfüggési tagot, de az aminosavak száma helyett a molekulatömeget, mint a peptid méretét jobban jellemző paramétert, alkalmazták:

(

)

Adamson és Reynolds a molekulatömeg kitevőjét ^{0, 435} (9) értékre módosítva használták ugyanezt a modellt^110,123.

Az összefüggés eltérő leírásainak ellenére megállapítható, hogy a peptidek mobilitása egyenesen arányos a töltésükkel, és fordított arányosság áll fenn a tömegük 1

3 és 1

2 közé

Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése

eső hatványával. A kisméretű peptidek kompakt szerkezetű (tight coil) egyszerű szerves ionokként viselkednek, ezért mobilitásuk M⁻¹³ hatvánnyal arányos. Míg a hosszabb peptidláncok kevésbé szabályos, véletlenszerű spirál (random coil) formáját feltételezve, a mobilitásuk M⁻¹³ és M⁻¹² lineáris kombinációjával arányosan fejezhető ki (az oldatban felvett valódi alakját, valamint az elektrosztatikus és egyéb kölcsönhatásokat tekintve ideális geometriájú véletlenszerű spirál esetén). Hosszú, denaturált polipeptidek és fehérjék lineáris láncot alkothatnak, melyek elektroforetikus mobilitása közvetlenül M értékével áll fordított arányban¹⁰⁵.

Számos publikáció született inkonzisztens következtetésekkel a fent ismertetett szemi-empirikus modellek hatékonyságáról. Az Offord-modell kapilláris zóna elektroforézisnél (CZE) való alkalmazhatóságát először Nyberg és munkatársai értékelték¹²⁴. Rickard et al.

jelentős korrelációt (r² =0, 948) tapasztaltak µ_ef és ₂

Q M

közt egy 33 peptidből és 10 fehérjéből álló adathalmazon¹¹⁷. Issaq és munkatársai a pH, puffer adalékok és a hőmérséklet hatásait vizsgálták kisméretű peptidek esetén¹²⁵. Azonos mértékben töltött polialaninek sorozatával érték el a legjobb korrelációt az elektroforetikus mobilitás és ₂

vizsgálatban¹⁰⁷. Hilser és munkatársai ugyancsak kiváló eredményeket (r=0, 908) adtak közre¹²⁶ a Grossman-modell felhasználásával 18 triptikus emésztmény peptidfragmentum vizsgálatával, melyek 2-21 aminosavból álltak, és a töltésük 0,31 és -2,39 közt változott.

Adamson és Reynolds valamivel jobb korrelációt értek el (r=0, 978) ugyanarra az adathalmazra egy pontosított modellt

( )

0,435 módosított Grossman-modelljükkel, 2-30 aminosavból álló, 0,75-8 töltéssel rendelkező peptidekkel kapott kísérleti adatokra¹⁰². Később Sanz-Nebot et al. még jobb korrelációt kaptak logaritmikus töltésfüggő modellek bevezetésével, mely a töltésszupressziós hatásokat is képes volt kompenzálni¹²⁷. Másrészről Chen és munkatársai kiváló korrelációt kaptak ₁

Q M összefüggéssel kifejezve µ_ef értékét¹²⁸. Egy évtizeddel később Kim et al. számos szemi

-empirikus modellt vizsgáltak egy 18 standard peptidből álló mintán, pozitív töltésű bevont kapillárissal, kapilláris elektroforézissel online kapcsolt elektrospay ionizációs tömegspektrometriás (CE-ESI-MS) detektálással¹²². A legjobb korrelációt az elektroforetikus mobilitás versus ^Q_0,56

M összefüggéssel kapták különböző töltésű (0,26-6,62) és méretű (1-10 aminosav) peptidekre. Ezzel szemben, Gaus és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy 14 különböző 6 körüli töltéssel rendelkező, 16-18 polimerizáció fokú peptidből álló kísérleti adathalmazukat sem az Offord-, sem a Grossman-modell nem írta le megfelelően¹²⁹. Survay et al. figyelemre méltó korrelációt értek el mind az Offord (r² ≥0, 996), mind a Grossman (r² ≥0, 996) modellekkel oligoglicinek és oligoalaninek (2-6 aminosavból álló oligomerek) elválasztásánál¹³⁰. Arra következtettek, hogy – mivel a kitevők széles skálája alkalmazható az adatok precíz leírására – a kétváltozós szemi-empirikus modellek egyike sem tekinthető kizárólagosan alkalmazhatónak a peptidmobilitás modellezésére.

A 2. táblázat foglalja össze a kétváltozós szemi-empirikus modelleket ismertető publikációkat, feltüntetve a CE módját, az alkalmazott puffer pH értékét, a minta komplexitását, az aminosavak számát ( )n , az alkalmazott peptidek töltését ( )Q és a szerzők által javasolt modelleket.

Függetlenül a publikációk eltéréseitől, látszólag az Offord-modell¹⁰⁶ gyakrabban eredményez jó egyezést, mint bármelyik másik szemi-empirikus modell, különösen változatos peptidek adataira alkalmazva111,113-117,125,131-132

. A közelmúltban Tessier és kollégái öt szemi-empirikus modellt vizsgáltak¹¹¹ a peptidmobilitást a töltés és méret hányadosával korreláltatva, 64 oligopeptidből álló adathalmazra, melyek 2-14 aminosavból álltak, és töltésük 0,29-től 6,74-ig változott. Ugyan egyik modell sem eredményezett tökéletes illeszkedést a kísérleti adatokra, a legjobb korrelációs együtthatót az Offord-modell eredményezte. Janini és munkatársai 58 peptidet vizsgáltak, melyek mérete 2-től 39 aminosav egységig változott, töltésük pedig 0,65-7,82 között¹¹⁶. Még újabb Khaledi és kollégáinak munkája, akik 125 standard, 2-14 aminosavból álló peptidet elemeztek¹¹⁴. Mindkét tanulmány kísérleti adatokat használt az ismert szemi-empirikus modellek értékelésére, az elektroforetikus mobilitás és a töltés-méret hányadosa közti korrelációt vizsgálva. Érdekes módon újfent az Offord-modell nyújtotta a legjobb egyezést a számított és a kísérleti µ_ef értékek közt^114,116.

Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése

2. táblázat: A kétváltozós szemi-empirikus modellek összefoglalása

Irodalom Mód^a pH Minták n Q Modellek^b

a Nagyhatékonyságú CE (HPCE), micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC), Doppler sebességmérés (DV), szabad oldat CE (FSCE), CE-tömegspektrometria (CE-MS), papír elektroforézis (PE)

1.3.1.1 A szemi-empirikus modellek hiányosságai

A nagyszámú elektroforetikus peptidmobilitás számítási próbálkozás102,106-108,110,122

dacára, egy univerzálisan minden peptidkategóriára alkalmazható, robosztus modell e paraméter pontos becslésére, mely csak a töltés és méret egy-egy jellemzőjére épül, még mindig nem létezik114,116,118,138. Ahogy az előző fejezetben bemutattam, Janini et al.¹¹⁶ és Jalali-Heravi et al.¹¹⁴ figyelemreméltóan sokszínű peptid adathalmazt használtak az elektroforetikus mobilitás töltéstől és mérettől való függésének vizsgálatára. Mindkét tanulmányban az Offord-egyenlet¹⁰⁶ nyújtotta a számított és a kísérleti µ_ef értékek közt a legjobb korrelációt az adathalmaz legtöbb peptidjére, ami alól csak az erősen töltött és hidrofób molekulák képeztek kivételt.

Tulajdonképpen a bemutatott modellek kizárólag a peptidek méretére és töltésére összpontosítanak. Következésképp a modellek teljesítménye nyilvánvalóan az ismert elsődleges szekvencia ésa két peptidjellemző közötti összefüggés választásától függ. Tehát e két paraméter meghatározásának pontosságát úgy kell értékelni, hogy szem előtt tartjuk, hogy az elektroforetikus mobilitás csupán két peptidjellemzővel történő leírása nem feltétlenül kielégítő, így e modellek hiányosságait okozhatja^111,114.

Annak érdekében, hogy a peptidminták töltését precízen meghatározzuk, a peptidet alkotó aminosavak disszociációs állandóit (pK) nagy pontossággal ismernünk kell¹³⁹. A gyakorlatban az aminosavak ionizálható funkciós csoportjairól hozzáférhető pK értékeket alkalmazzák minden peptidhez függetlenül az összetételüktől, illetve szekvenciájuktól. Ez minden bizonnyal a peptid töltésének hibás becsléséhez vezet, mivel az aminosav oldalláncok ionizációját egy adott környezetben a szomszédos csoportok elektrosztatikus és sztérikus hatásai is befolyásolják¹¹⁷. A peptidekben a sztérikus és elektrosztatikus hatások főleg az összetételtől és az aminosav sorrendtől függenek, így a módszer a pK meghatározás és ezáltal az ezt követő töltésszámítás során egyaránt hibát okozhat¹¹⁴. Sőt, ahogy Cross és Granham megállapították, a töltéseloszlás az egyik fő tényező, mely szerepet játszik a peptidek és feltehetőleg minden vizes oldatban elektromigráló komponens mobilitásában¹³⁸.

Ahogy korábban leírtam, gyakran a molekulatömeget használják a peptidek méretének jellemzésére. Ugyan a molekulatömeg pontos hatása az elektroforetikus mobilitásra még nem ismert, mivel az elektroforetikus mobilitás molekulatömeg-függése az irodalomban némileg ellentmondásos. Compton megmutatta, hogy a kis molekulák mobilitása kis ionerősségű

Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése pufferekben ₁

1 M

-nal áll szoros összefüggésben¹⁰⁸. Másrészt a nagyméretű molekulák mobilitása nagy ionerősségű pufferben ₂

1 M

-nal korrelál. Közepes méretű molekulák és puffer ionerősség mellett ₁

1 M

összefüggés mutatkozik¹¹⁴. Egy másik figyelembe veendő tényező, mely a peptid méretének meghatározása, és az ezen alapuló mobilitás becslés során hibák forrása lehet, a minta hidratációja¹³⁸. Janini és munkatársai mutatták meg, hogy a peptid hidrofobititását a kétváltozós modellek nem veszik figyelembe, így részben ez felelős a mobilitás gyenge előrejelzéséért¹¹⁵. A peptid hidrodinamikus térfogatának és alakjának alkalmazását javasolták a molekulatömeg helyett Piaggio et al., hogy a peptid súrlódási együtthatóját meghatározzák, és releváns alternatívát nyújtsanak, mely segíthet CZE eredményekből nyert információk alapján a hidratációs jelenséget interpretálni¹⁴⁰.

Végül szeretném hangsúlyozni, hogy az általános feltételezés az elektroforetikus mobilitás töltés-méret aránnyal való kapcsolatáról általában a lehetséges nem-lineáris összefüggést teljes mértékben figyelmen kívül hagyja. Ezzel a problémával Cross és Garnham is szembesültek¹³⁸, és így arra következtettek, hogy az Offord-egyenlet¹⁰⁶ nem megfelelő modell a különböző méretű, töltésű vagy hidrofobitású peptidek széles skálájának elektroforetikus mobilitásának leírására.

Azért, hogy a hagyományos szemi-empirikus modellek említett hiányosságaival megbirkózzunk két stratégia alkalmazása merült fel napjainkban a peptidek elektroforetikus mobilitásának precízebb előrejelzésére:

• A kétváltozós QSPR modellek kiterjesztése, további peptidparaméterek figyelembevételével a modellek prediktív teljesítményének növelésére, és alkalmazhatósági tartományuk kiterjesztésére az összes különböző peptidcsoportra

114-115,118,136

;

• Nem-lineáris modellezési módszerek – mint a mesterséges neurális hálózatok – használata, precízebb és robosztusabb QSPR modellek kidolgozásához103,114,118,120

1.3.2 Többváltozós modellek

Annak érdekében, hogy az Offord-modellből származó hiányosságokat kiküszöböljék, Metral el al. egy új megközelítést vizsgáltak¹³⁶, hogy további fizikai jellemzőket vegyenek számításba, melyeket a kétváltozós modellek figyelmen kívül hagynak. Modelljükben a

peptidek elektroforetikus mobilitását négy fizikai paraméter függvényének szorzataként fejezték ki:

( ) ( ) ( ) ( ) l L q Q w W c CC

µ = (10)

ahol L a peptid hossza az aminosavak számával megadva, W a peptid szélessége az oldalláncok átlagos molekulatömegével kifejezve, és CC (charge center) a töltésközéppont tömegközépponthoz viszonyított relatív helyzetét jelöli. A tömeget kétdimenziós változóvá alakítva lehetőség nyílik a peptidek közti különbségek jobb leírására, és így nagyobb peptidhalmazok kezelésére. Összesen 64, különböző fizikai paraméterrel rendelkező peptidet vizsgáltak, melyek töltése 0,65-től 7,82-ig, méretük 2-től 39 aminosavig terjedt. A kísérleti eredményeket, azaz peptidmobilitásokat, 10% poliakrilamiddal bevont kapillárisokkal, 50 mM koncentrációjú foszfát pufferrel (pH 2,5) nyerték. Az UV detektálás 200 nm hullámhosszon történt. Az elválasztásokat 22°C hőmérsékleten végezték. Ebben az esetben a publikált eredmények alapján végzet ismételt számításaink¹⁴¹, hogy az Offord-modellt alkalmazzuk a teljes adathalmazra, elég gyenge korrelációt (r² =0, 728) eredményeztek a kísérleti mobilitásokkal. Ugyanakkor a négy legnagyobb töltésű peptid kihagyásával, melyek a linearitástól különösen nagy eltérést mutattak, az Offord-modell teljesítménye jelentősen javult (r² =0, 931). Összehasonlítva a kísérleti adatokat a többváltozós modellel kapott mobilitás értékekkel, a korreláció tovább javult (r² =0, 980). A szerzők által alkalmazott eljárás teljesen empirikus természetű, és nem tükröz elméleti megfontolásokat. Megmutatták, hogy egy peptid elektroforetikus mobilitását lényegében a töltés, az aminosav alkotók száma, átlagos tömege és a töltés középpontjának helye befolyásolja. A módszer szimulált és kísérleti értékek eltérésével mért sikere, kizárólag a nagyszámú, eltérő töltésű és méretű peptid elektroforetikus mobilitásának mérésének pontosságán múlik. Így fontos észrevenni, hogy szemben a kétváltozós modellekkel, a töltés értékek pontos meghatározása nem nélkülözhetetlen ehhez a megközelítéshez, amíg a töltésszámításhoz alkalmazott módszer következet. Metral és munkatársai módszerét¹³⁶ Jalali-Heravi et al.¹¹⁸ kifogásolták, állítva, hogy ugyan megfelelő korrelációs értékeket kaptak, azonban minden a modellben megjelenő függvény adatfüggő volt.

Janini és munkatársai az imént ismertetett modell¹³⁶ módosított verzióját mutatták be. Egy újabb számítógépes többváltozós modellt alkottak a peptidek elektroforetikus mobilitásának előrejelzésére, azok aminosav-összetevőinek ismert fizikai-kémiai tulajdonságaira építve. A modelljüket fehérje emésztmények CZE peptidtérképeinek szimulációjára alkalmazták¹¹⁵.

Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése

Összehasonlítva előző modelljükkel¹¹⁶, több peptidet építettek be az alap mintahalmazba, és egy számítógépes algoritmust vettek igénybe, mely az ismeretlen peptidek fizikai paramétereit a peptidhalmazban legközelebbi szomszédjaikéból extrapolálva adta meg, a pontosabb mobilitás becslés érdekében. E modell feltételezi, hogy az elektroforetikus mobilitás három függvény szorzatával kifejezhető, melyek a peptid töltésének ^{( )}^Q , hosszának ( )N és szélességének (W) hatását tükrözik:

( ) ( ) ( ) n N q Q w W

µ= (11)

Az egyenlet által leírt modell változatos peptidek halmazának elektroforetikus mobilitásainak pontos kísérleti mérésén alapszik. A CZE elválasztásokat 22°C-on, 50 mM koncentrációjú foszfát pufferrel (pH 2,5) kivitelezték. Egy 102 peptidből – melyek méret (2-42 aminosav) és töltés (0,65-16) szerint széles skálán változtak – álló halmaz akkurátus méréseit végezték el 10% lineáris poliakrilamiddal bevont kapillárisban. A többváltozós számítógépes modell minden peptidkategóriában jelentős előrejelzési javulást eredményezett

(r2 =0, 98) az Offord-modellel összevetve (r2 =0, 90), beleértve az erősen töltött és hidrofób típusokat is. A modell proteomikai vizsgálatoknál való alkalmazhatóságát glukagon és lóból származó citokróm C emésztmények elméleti peptidtérképeinek szimulálásán keresztül szemléltették. Az elektroforetikus mobilitásokat migrációs időkké alakították, és a CZE elektroferogramokat Gauss görbékkel szimulálták.

A glukagon kísérleti eredménye megdöbbentő egyezést mutatott a szimulált elektroferogrammal (6. ábra). A citokróm C esetében érdekes hasonlóságokat értek ugyan el, de az elektroferogramok a közvetlen megfeleltetést nem tették lehetővé. Ugyanakkor ismét észre kell venni, hogy ez a modell is teljes mértékben empirikus, és semmilyen elméleti összefüggést nem tartalmaz¹³⁶.

2005-ös publikációjukban¹¹⁸ Jalali-Heravi és munkatársai a Janini-féle megközelítést kritizálták. Rámutattak, hogy a modell sikere a nagyszámú peptid elektroforetikus

6. ábra: Glukagon Glu-C endoproteináz emésztményének kísérleti és szimulált elektroferogramjai (µ_ef cm²V^-1s^-1 egységben)¹¹⁵

mobilitásának kísérleti mérési pontosságán múlik. Más szóval, a modelljük a legközelebbi szomszéd (closest neighbour) algoritmuson alapszik, így nem lehet megfelelően robosztus.

Jalali-Heravi és munkatársai nemrég egy újabb többváltozós modellt dolgoztak ki, hogy a töltés és méret mellett, további szerkezeti jellemzők kapilláris zóna elektroforetikus mobilitásra kifejtett hatásait is megértsék^114,118. Kiterjedt, 125 peptidre épülő adathalmazt generáltak. A peptidek mérete 2-től 14 aminosavig változott, töltésük pedig 0,734-től 5,843 -ig. A peptidek elektroforetikus mobilitását bevonatlan kvarc (bare fused silica) kapillárissal CZE módban mérték, 2,5-ös pH-jú, 50 mM koncentrációjú foszfát puffert alkalmazva. A detektálás 214 nm hullámhosszon történt, és az elválasztásokat 37°C-on végezték. Egy többszörös lineáris regressziós (MLR: multiple linear regression) eljárást alkalmaztak a QSPR modellben szereplőtovábbi peptidjellemzők kiválasztásához, melyekkel az Offord-féle

In document Fehérjék glikozilációjának nyomon követése és peptidek analitikai elválasztásának (Pldal 36-54)