Mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoziláció profilozás

A munka folytatásaként a BLAC módszer miniatürizálását és automatizálását végeztük el, és a gyakorlatban is hasznosítottuk a humán szérum glikoziláció vizsgálatára kidolgozott metodika (lásd 3.1 fejezet) hatékonyságának további növelésére. A kidolgozott metodika a következő lépések sorozatából áll: ultraszűrés, mikropreparatív glikoaffinitás alapú glikoprotein dúsítás, enzimatikus glikán felszabadítás, fluorofór cukor jelölés, poszt-derivatizációs tisztítás és kapilláris gél elektroforetikus analízis. A 17. ábra szemlélteti vázlatosan a mintaelőkészítés és analízis lépéseit, melyet a komparatív glikán profil vizsgálatokhoz dolgoztunk ki.

17. ábra: A humán szérum mintaelőkészítési és elemzési folyamatának sematikus összefoglalása BLAC/ConA mikropreparatív glikoprotein izolálással és kapilláris gél elektroforézissel

Első lépésben a kevert (pooled: nagyszámú minta keveréke) normál vagy prosztata karcinómás szérumból a kismolekulák ultraszűréses eltávolítása történik. Könnyen belátható, hogy a vicinális hidroxil csoportokat tartalmazó glükóz is kiválóan kötődik az affinitás állófázishoz, ezért eltávolítása a glikoproteinek izolálása előtt indokolt. Ezt követi szérum makromolekula tartalmának BLAC/ConA mikropreparatív affinitás kromatográfiás frakcionálása, mellyel a vizsgálni kívánt glikoproteinek szelektíven izolálhatók. A feldúsított szérum glikoproteinekből az N-glikánokat PNGaseF emésztéssel enzimatikusan felszabadítottuk, majd 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonáttal jelöltük reduktív aminálási reakcióval. Normál fázisú kromatográfiás módszert alkalmaztunk a reagálatlan szabad

jelölőanyag (APTS) poszt-derivatizációs eltávolítására. Végül a mintákat komparatív LED-indukált fluoreszcenciás detektálású multikapilláris gél elektroforézisnek alávetve a glikozilációs profilokat értékeltük.

3.3.1.1 BLAC/ConA mikropreparatív glikoprotein dúsítás

18. ábra: A mikropreparatív affinitás kromatográfiás szérum glikoprotein dúsítás összehasonlítása boronsav (A), konkanavalin A (B) és kombinált BLAC/ConA (C) állófázisok alkalmazásával. A számozott csúcsok a jelölt glikánokat reprezentálják. Kapilláris gél elektroforetikus körülmények: 30 cm effektív hosszúságú, 20 µm belső átmérőjű kvarc kapilláris; háttér elektrolit: 25 mM acetát (pH 4,75); 8 kV alkalmazott feszültség 20°C-on;

injektálás: 2 kV 20 s

A glikoproteinek izolálására és dúsítására a humán szérum mintákból kombinált boronsav - konkanavalin A (BLAC/ConA) mikropreparatív affinitás kromatográfiás technikát alkalmaztuk. A 18. ábra hasonlítja össze a APTS jelölt szérum N-glikánok kapilláris gél elektroforetikus profiljait boronsav- (A elektroferogram), konkanavalin A affinitás kromatográfiás (B elektroferogram) és kombinált BLAC/ConA kromatográfiás (C elektroferogram) glikoprotein dúsítás után kevert normál humán szérumokból. A csúcsok mintázatainak eltérése szembetűnő az 1, 3, 4, 5, 10, 11 és 15 csúcsok összehasonlításával.

Például a 4-es csúcs csak a boronát állófázishoz kötődik (A), és így jelen van a BLAC/ConA állófázissal kezelt mintában is (C), azonban a konkanavalin A állófázissal kezelt szérum

Mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoziláció profilozás

profiljából hiányzik (B). Hasonlóan a 15-ös csúcs a konkanavalin A-ra specifikus glikán, mely megjelenik a konkanavalin A (B) és BLAC/ConA (C) állófázissal kezelt mintákban, azonban a boronsav kromatográfiás elektroferogramról (A) hiányzik. A kombinált BLAC/ConA állófázissal kezelt mintában néhány csúcs relatív intenzitása eltérést mutat az egyes állófázisokkal külön kezelt mintáktól, néhány extrém esetben nehezen látható az alkalmazott detektálási érzékenységgel az A és B elektroferogramokon (ilyenek az 1, 3, 5, 10 és 11 csúcsok).

Első közelítésben a konkanavalin A és a boronsav feltételezett kombinált hatásával magyarázható ez a jelenség, mely a kötési erősség és/vagy kapacitás eltérését okozhatja a kombinált formánál¹⁶². A munka folytatásaként konkanavalin A és boronsav eltérő arányú keverékeivel, illetve boronsav más lektinekkel való kombinációjával e jelenség és a mögötte húzódó mechanizmus megértésére lehetőség nyílhat.

A 19. ábra normál humán szérum APTS jelölt N-glikánjainak elektroforetikus profiljait mutatja be BLAC/ConA mikropreparatív glikoprotein dúsítás alkalmazásával (A) és affinitás kromatográfiás kezelés nélkül (B). Az elektroferogramok releváns részei mindkét panelen nagyítva is bemutatásra kerültek. A csúcsok magasságait a kinagyított részleteken normalizáltuk a legnagyobb intenzitású csúcsra (mindkét esetben a 7-es csúcs), melynek magasságát 10,0 RFU értéknek vettük. A glikáncsúcsok egyértelmű azonosítása érdekében csak a 0,2 relatív fluoreszcencia egységet (RFU) meghaladó intenzitású csúcsok jel-zaj viszonyát tekintettük elfogadhatónak, ezek az ábrán számozással vannak feltüntetve.

Jól látható az ábrán, hogy a BLAC/ConA glikoprotein dúsítással preparált minta esetén jelentősen nagyobb mennyiségű glikán csúcs felelt meg a kritériumnak (17 számozott csúcs a 12-vel szemben). Ugyanakkor a csúcsok magasságainak eloszlása is eltérést mutatott BLAC/ConA kezelés után (1, 2, 4, 6, 12, 15, és 17-es csúcsok). Ennek magyarázata valószínűleg az, hogy ezek a humán szérumban nagyságrendileg alacsonyabb koncentrációban jelenlévő glikoproteinek nagyobb affinitással rendelkeznek a kombinált BLAC/ConA állófázishoz, és ezért feldúsulnak az affinitás kromatográfiás kezeléssel (v.ö. 19.

ábra kinagyított részei).

19. ábra: APTS jelölt normál szérum glikánok kapilláris gél elektroferogramjai BLAC/ConA affinitás kromatográfiás glikoprotein dúsítással (A) és nélküle (B). A 0,2 relatív fluoreszcencia egységet meghaladó csúcsokat tekintettük relevánsnak, és ezek az elektroferogramokon számozással kerültek megjelölésre. Az elválasztás során alkalmazott 4 kV feszültség kivételével az egyéb körülmények a 18. ábra által bemutatottakkal megegyeznek.

3.3.1.2 Komparatív glikozilációs profil vizsgálat

Egészséges egyénektől származó (kereskedelemben elérhető) és öt negyedik stádiumú prosztata karcinómás beteg kevert szérum mintáinak glikoproteinjeit izoláltuk a BLAC/ConA mikropreparatív affinitás kromatográfiás technikával, és az 17. ábra által bemutatott

Mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoziláció profilozás

downstream mintaelőkészítési és elemzési módszert kiviteleztük velük. A minták glikozilációs profiljainak összehasonlítását a 20. ábra mutatja be.

20. ábra: Normál pooled humán szérum (alsó elektroferogram) és prosztata karcinómás szérum (felső elektroferogram) N-glikozilációs profiljainak összehasonlító kapilláris gél elektroferogramjai BLAC/ConA mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoprotein dúsítással. A számok (1-16) a 18. ábra és 19. ábra számozott csúcsait jelölik. A prosztata rák specifikus glikozilációs mintázatokat betűk (A-D) jelölik. Az elválasztás körülményei megegyeznek a 18. ábra által bemutatottakkal.

Az alsó elektroferogramon látható számozott csúcsok a BLAC/ConA technikával kezelt normál humán szérum N-glikozilációs profiljára jellemző mintázatot mutatnak. Hasonlóképpen a megfelelő csúcsokat a felső, BLAC/ConA affinitás kromatográfiásan dúsított prosztata rákos humán szérum minta elektroferogramján is megszámoztuk. Amíg a csúcsok túlnyomó többsége megfeleltethető egymásnak a két elektroferogramon, megfigyelhető négy további csúcs (A, B, C és D), melyek egyértelműen csak a prosztata karcinómás szérum glikán profiljában vannak jelen. Ezek (vagy ezek egy része) nagy valószínűséggel a glikozilációs mintázat prosztata rák specifikus megváltozásának eredményei. Ezeket a szénhidrátokat további munka keretében érdemes biológiai marker potenciáljuk feltérképezése érdekében további szerkezeti és biológiai vizsgálatoknak alávetni.

A két profil közös csúcsainak némelyike (2, 4, 5 és 9) láthatólag a csúcsarány szempontjából eltérést mutat, ezek is hordozhatnak diagnosztikai információt, ezért további vizsgálatuk indokolt lehet.

3.3.2 Következtetések

A munka első részében kidolgoztuk az N-glikozilációs profil kapilláris elektroforézis alapú vizsgálatának metodikáját. Párhuzamosan kidolgozásra került a vizsgálni kívánt glikoproteinek megkötésére és szelektív elúciójára a boronsav - lektin affinitás kromatográfia, mely boronsav és különböző lektinek keverékét tartalmazó állófázisokat alkalmaz egy elválasztó oszlopban (BLAC)¹⁴⁹. A munka folytatásaként a BLAC/ConA állófázis miniatürizált és automatizált specifikus glikoprotein dúsítási alkalmazását dolgoztuk ki. A technikát humán szérum mintaelőkészítésre alkalmaztuk egészséges és prosztata karcinómás minták glikozilációs profil összehasonlító vizsgálatához. A glikán profilok eltéréseit LED- indukált fluoreszcenciás detektálású multikapilláris gél elektroforézissel vizsgáltuk. A glikoprotein dúsítást egylépéses elúcióval mindössze 5 µL állófázist tartalmazó mikrokolonnákkal végeztük. A 17. ábra által bemutatott munkamenet alkalmazásával a kevert prosztata karcinómás szérum minta komparatív glikozilációs profil vizsgálata lehetővé tette az egészséges egyénekből származó mintákhoz képest eltérések azonosítását.

Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

3.4 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus