• Nem Talált Eredményt

Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi -kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez

2 Kísérleti rész

3.1 Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi -kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez

3.1.1 A jelölőanyag feleslegének eltávolítása az analízist megelőzően

Az ANTS és APTS jelölés kapcsán felmerülő egyik probléma a derivatizációs reakcióelegyben jelenlévő jelölőanyag nagy moláris feleslege. Az mintában maradó nagy mennyiségű reagálatlan jelölőanyag a kisebb (néhány cukoregységből álló) oligoszacharidok kimutatását zavarja, mivel ezek a kapillárisban látszólag együtt migrálva átfedésbe kerülnek a túltelített jelölőanyag csúccsal. Sőt a mintaelegyben lévő nagy fajlagos töltésű jelölőanyag az elektrokinetikus injektálású kapilláris elektroforézis rendszerekben további nehézségeket eredményez156, mivel szupresszálja az injektálás során a nagyobb molekulatömegű, kisebb elektroforetikus mobilitású mintakomponenseket. Ezért a megfelelő detektálhatóság érdekében alacsony mintakoncentráció, polimerizáció fok vagy a nyomással történő mintabevitelt nem támogató analízis – a manuális rendszerek túlnyomó többsége és számos kereskedelemben kapható viszkózus géleket tartalmazó készülék – egyaránt megköveteli a minta megtisztítását a szabad jelölőanyagtól az injektálást megelőzően. A probléma megoldása érdekében három jelölőanyag (APTS) eltávolítási módszer hatékonyságának értékelését és kritikai összevetését végeztük el a lehető legjobb minta visszanyerési arány érdekében.

A 10. ábra szemlélteti az egyes módszerek hatékonyságának összehasonlítását a megtisztítatlan APTS-jelölt mintával. A minta mind a négy esetben különböző polimerizáció fokú maltooligoszacharidokat (M040 maltodextrin: keményítő szabályozott hidrolízisével előállított, alacsony polimerizáció fokú, α-D-glükóz egységekből felépülő oligoszacharidok keveréke) tartalmazott. Alulról felfelé a minták a következő sorrendben kerültek bemutatásra az ábrán: kezeletlen oligoszacharid létra, Sephadex G10 méretkizárásos állófázist tartalmazó Multiscreen 96-well szűrőplate-tel kezelt minta, Sephadex G10 méretkizárásos állófázist tartalmazó PhyTip kromatográfiás pipettaheggyel kezelt minta és a DPA-6S normál fázisú poliamid állófázist tartalmazó PhyTip kromatográfiás pipettaheggyel kezet minta elektroferogramjai. Ahogy az ábrán is jól látható, mindhárom módszer a detektálhatóság növekedését eredményezte a kezeletlen mintához képest, ám a poliamid állófázis

kiemelkedően teljesített a reagálatlan jelölőanyag eltávolításában (v.ö. a csúcsok relatív magassága az első – APTS – csúcshoz képest, illetve az egyes elektroferogramokon látható csúcsok összes száma).

10. ábra: A reagálatlan jelölőanyag (APTS) eltávolítási módszereinek összehasonlítása a jelölési reakcióelegyből. A legalsó elektroferogram: a tisztítatlan M040 maltodextrin létra elemzése, felette: a Sephadex G10 Multiscreen szűrőplate-en kezelt minta, majd efelett: Sephadex G10 PhyTip eljárással kezelt minta, legfelső elektroferogram: DPA-6S normál fázisú eljárással kezelt maltodextrin létra. Az elválasztás körülményei: 10 cm effektív hosszúságú kapilláris, 3kV feszültség, szobahőmérsékleten (20°C), elektrokinetikus injektálás: 2 kV 20 s. Detektálás: kék LED fényforrás (excitáció: 46-470 nm, 520 nm emissziós szűrő)

Ezért a további kísérletekben a DPA-6S normál fázisú poliamid gyantát tartalmazó hegyeket használtuk PNGase F enzimmel emésztett, APTS molekulákkal jelölt glikoprotein minták vizsgálatánál, a jelölési reakció lejátszódása után a reagálatlan, szabad jelölőanyag eltávolítására a minta elegyekből. A vizsgált glikoproteinek a következők voltak:

immunglobulin G (IgG), ribonukleáz B (RNaseB), fetuin magzati szarvasmarhából (fetal bovine fetuin: FET), α-1-savanyú-glikoprotein (AGP). A glikoproteinek fluoreszcensen jelölt glikánjainak multi-kapilláris gél elektroforézises elválasztását 10 és 30 cm effektív hosszúságú kapillárisokkal (12 és 4 csatornás cartridge) egyaránt elvégeztük. A kísérletek eredményeit különböző glikoproteinekből származó mintákon keresztül a 11. ábra mutatja be.

Az ábra A részének felső elektroferogramja az α-1-savanyú-glikoproteinből nyert minta elemzését mutatja, ahol az erősen szialilált szerkezetek jellemző csúcsai jól láthatóak körülbelül 8 percnél. A magzati szarvasmarha fetuin (FET) gyorsan migráló (5 perc körül

Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez detektált), három illetve négy sziálsavat tartalmazó szerkezeteinek (F1-F4) csúcsai jól elkülönülnek. A ribonukleáz B sávján jól látszanak az öt főbb, jól ismert magasabb mannóz szerkezetű izomer csúcsai (M5-M9). Az immunglobulin G sávja az immunglobulinok glikánjaira jellemző tipikus mintázatot mutatja.

Az elválasztások felbontó képességének növelése érdekében 10-ről 30 cm-re növeltük a kapillárisok effektív elválasztási hosszát, ez esetben négycsatornás (négy párhuzamos elválasztás szimultán kivitelezését lehetővé tevő) cartridge alkalmazásával. Szemléltetésként a 11. ábra B része két elválasztást mutat be, melyek a felbontás javulását jól példázzák. A felső elektroferogramon a három és négy sziálsavat tartalmazó fetuin glikán szerkezetek két-két izomerét (F1, F2 és F3, F4) is jól láthatóan sikerült elválasztani, szemben a rövidebb kapillárissal, ahol ezek a dupla csúcsok nem azonosíthatóak. Az alsó elválasztás a ribonukleáz B pozíciós izomer glikánjainak – Mannóz-7 (M7abc) és Mannóz-8 (M8abc) – megfelelő felbontású elektroferogramja.

11. ábra: DPA-6S kezelt APTS-jelölt különböző glikoproteinekből nyert glikánok kapilláris gél elektroforetikus profiljai.

Minták: α-1-savanyú glikoprotein (AGP), fetuin magzati szarvasmarhából (FET), ribonukleáz B (RNaseB), immunglobulin G (IgG). A panel: 10 cm effektív elválasztási hossz, 3 kV alkalmazott feszültség; B panel: 30 cm effektív elválasztási hossz, 3 kV alkalmazott feszültség; az egyéb elválasztási körülmények megegyeznek a 10.

ábra esetén ismertetettekkel.

3.1.2 Humán szérum minták monoszacharid tartalmának eltávolítása

Glikoprotein standardok elemzése során a mátrixhatással összefüggő problémák nem jelentkeznek, mivel ilyenkor a megfelelő oldószerek és reagensek megválaszthatóak úgy, hogy a derivatizációs és/vagy elválasztási folyamatokat ne zavarják. Ugyanakkor biológiai

minták vizsgálata során, a mintamátrix jelentős problémákat okozhat. Így humán szérum minták glikozilációs profiljának vizsgálatánál szembesülnünk kellett a viszonylag magas vércukor szint következtében fellépő zavaró hatással. Mivel a jelölési reakcióban a felszabadított glikánokkal együtt a vérkészítményekben relatív nagy mennyiségben található glükóz is megjelölődik, nemcsak kompetíciót alakít ki a nagyobb, komplexebb glikán szerkezetekkel, de elektrokinetikus injektálás során a vizsgálni kívánt molekulák kapillárisba való bejutását is gátolja ion szupresszió által. Különböző módszereket vizsgáltunk a minta vércukor tartalmának a glikoprotein oligoszacharidok enzimatikus felszabadítását megelőző eltávolítására humán szérum mintákból. A glükóz eltávolításra C-18 fordított fázisú kromatográfiás mikropipettákkal történő elválasztást és ultraszűrést egyaránt kipróbáltuk.

Eredményeink azt mutatták, hogy a 3 és 10 kDa pórusméretű ultraszűrő eszközök egyaránt jelentősen hatékonyabbnak bizonyultak mint a fordított fázisú állófázist tartalmazó pipetta hegyek. Az egyetlen főbb különbség a 3 és 10 kDa pórusú ultraszűrők között a centrifugálás időigénye volt, ami a 3 kDa-os eszköz esetében a nagyobb hidrodinamikai ellenállás következtében jelentősen megnőtt. A 12. ábra mutatja az APTS jelölt N-glikánok profiljainak összehasonlítását (A) glükóz-eltávolítás nélkül, illetve (B) 3 kDa pórusméretű ultraszűrés alkalmazásával a mintaelőkészítés során. Fontos kiemelni, hogy a jel intenzitása és a jel-zaj arány az elektroferogramokon az ultraszűrés után látványosan javul. Ezt a lépést nélkülözhetetlennek tekinthetjük, ha a humán szérum glikánok finom eloszlásának vizsgálata a cél, melyek profilja értékes diagnosztikai információt szolgáltathat, mint a megváltozott glikozilációs mintázatok.

12. ábra: Humán szérum minta monoszacharid tartalmának ultraszűréses eltávolítása kapilláris gél elektroforézis analízissel. A rész: normál humán szérum PNGaseF enzimmel emésztve, APTS jelölés és azt követő DPA-6S kezelés után; B rész: azonos minta az enzimemésztést megelőző 3 kDa pórusméretű ultraszűréssel. Az elválasztás körülményei megegyeztek az 10. ábra által bemutatottakkal.

Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez 3.1.3 Illékony pufferrendszer exoglikozidáz emésztéshez

A vizsgálni kívánt glikoproteinekből felszabadított szénhidrát szerkezetek összetételének és kapcsolódási információjának meghatározásához enzimatikus analízist alkalmazhatunk specifikus exoglikozidázokkal. Például, szénhidrát szekvenálást végezhetünk enzim mátrixszal kivitelezett emésztéssel, mely gondosan választott exoglikozidázok keverékét tartalmazza157. Az exoglikozidáz alapú szénhidrát analízis bármilyen kapilláris elektroforetikus módszerrel alkalmazható, beleértve a multi-kapilláris gél elektroforézist is.

Ugyanakkor, amennyiben elektrokinetikus injektálás a kizárólagos lehetőség, szükséges a reakció puffer nagy ionerősségű összetevőinek megfelelő módosítása, vagy eltávolításuk az injektálás előtt. Ezesetben az ultraszűrés nem megfelelő lehetőség, mivel méretüknél fogva a jelölt oligoszacharidok egy jelentős része is elveszne. Azért illékony összetevőket tartalmazó reakció puffer alkalmazása kínálkozott jó lehetőségnek, mivel a CE analízis előtt ezek eltávolítása egyszerűen megoldható.

Acetát, formiát és karbonát alapú, 0,1 M koncentrációjú puffereket vizsgáltunk, melyek pH-ját ammónium-hidroxiddal állítottuk be a reakció szempontjából optimális 5,5-ös értékre. Az eljárás alkalmazhatóságának igazolására neuraminidáz enzimet választottunk a sziálsav csoportok enzimatikus felszabadítására a magzati szarvasmarha fetuin glikánjaiból. Tíz órás 37°C-os inkubálás után a neuraminidáz enzimmel az illékony puffer összetevőket centrifugális vákuum bepárlással távolítottuk el. Az ammónium-acetát reakció puffer bizonyult az emésztési és bepárlási kísérletek alapján a leghatékonyabbnak.

A 13. ábra az elektroferogramok releváns részeit kinagyítva mutatja be. Az emésztetlen magzati szarvasmarha fetuin glikánokat a felső elektroferogram szemlélteti, jelölve a két-két négy illetve három sziálsavat tartalmazó glikán dupla csúcsaihoz tartozó molekulák szerkezeteit is (F1, F2 és F3, F4). A középső elválasztáson a 0,1 M koncentrációjú ammónium-acetát pufferben (pH 5,5) végzett neuraminidáz emésztés eredménye látható.

Mivel az elválasztás 4,5-ös pH-ján minden sziálsav csoport disszociálva van, eltávolításuk a mintamolekulák tömeg-töltés arányát megnöveli, lassabb migrációt, a migrációs idők növekedését eredményezve. A középső futáson jelölt A3 csúcs a deszialilált F1-F4 glikánokat jelöli, például minden α2-3 és α2-6 kapcsolódású Neu5Ac eltávolítása után a Man(α1-6) és Man(α1-3) oldalláncokról. A2 jelöli a Gal(β1-3) – GlcNAc középső antennájának Man(α1-6) kapcsolódású oldallánc izomerének deszialilált alakját. A korábbi eredmények alapján e csúcs feltételezhetően egy az F3 csúccsal együtt vándorló csúcsból származik14. A1 feltehetőleg az emésztési reakció Gal(β 1-4) kapcsolódású biantennáris mellékterméke158. A 13. ábra alsó

elektroferogramja egy kontroll kísérlet eredményét mutatja aszialofetuinból felszabadított jelölt glikánok elválasztásával. Fontos észrevenni a csúcseloszlás nagyfokú hasonlóságait a deszialilációs kísérlet és az aszialofetuin elektroferogramja közt.

13. ábra: Neuraminidáz emésztés termékeinek kapilláris gél elektroforetikus elemzése magzati szarvasmarha fetuinból felszabadított glikánokkal, illékony ammónium-acetát reakció pufferrel. Felső elektroferogram: APTS jelölt fetuin glikánok; középső elválasztás: APTS jelölt, neuraminidáz emésztett fetuin glikánok; alsó elválasztás:

APTS jelölt aszialofetuin glikánok (kontroll). Szimbólumok: ♦ : sziálsav (Neu5Ac); □ : Galaktóz; ○ : Mannóz;

■ : N-acetil-glükózamin (GlcNAc). Körülmények:30 cm effektív elválasztási hossz, 3 kV alkalmazott feszültség.

Egyéb körülmények megegyeznek az 10. ábra által bemutatottakkal.

3.1.4 Következtetések

A komplex szénhidrátok nagyhatékonyságú kapilláris elektroforetikus elválasztása gyorsan fejlődő terület. A multikapilláris formátumú alkalmazás a glikoziláció változásainak nagy teljesítményű elemzését teszi lehetővé, egyrészt az oligoszacharid eloszlás természetének és/vagy mértékének (profilozás/profiling) vizsgálatával, másrészt exoglikozidáz alapú emésztéses (szekvenálás) analízisével. Mivel a cukrok csak kivételesen tartalmaznak töltést hordozó, kromofór vagy fluorofór csoportokat, elektroforetikus elemzésük megfelelő jelölési módszert követel meg. A 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonát (APTS) a célra az egyik

Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez leggyakrabban alkalmazott reagens, mely lehetővé teszi a fluoreszcens detektálást látható kék fényt emittáló LED hatására. Az APTS jelölés az elektroforetikus elválasztáshoz szükséges töltést is biztosítja a mintamolekuláknak. Ugyanakkor a derivatizációs reakció kiváló kihozatalához szükséges APTS nagy moláris feleslege a reakcióelegyben az injektálás és elválasztás során komoly nehézségeket eredményezhet. Az injektálás során kifejtett zavaró hatása mellett, az oldatban maradó konjugálatlan jelölőanyag a kisméretű oligoszacharidok kimutatását is megnehezíti, mivel gyakran ezek az elválasztás során együtt vándorolnak egy túltelített átlapoló elektroforetikus csúcsot eredményezve.

Munkám során a jelölő anyag kapilláris elektroforetikus elemzést megelőző három minta -előkészítési módszert értékeltem. Sephadex G10 méretkizárásos kromatográfiás módszert alkalmaztunk Multiscreen 96-well szűrőplate-tel és automatizált folyadékkezelő robottal kis térfogatú kromatográfiás pipetta hegy formátumban egyaránt, valamint normál fázisú poliamid DPA-6S állófázist vizsgáltunk kromatográfiás pipetta hegy formátumban.

Mindhárom módszer képesnek bizonyult az APTS eltávolítására nagyobb érzékenységet eredményezve a jelölt szénhidrátok analízise során, ugyanakkor a DPA-6S poliamidot tartalmazó pipetta hegyek eredményezték kimagaslóan a legjobb hatásfokot. A humán szérum glikozilációs profiljának vizsgálatához nélkülözhetetlen minta-előkészítési feladatot, a minta glükóz tartalmának eltávolítását, ultraszűréssel sikerült hatékonyan megoldani. Az exoglikozidáz emésztésen alapuló szénhidrát elemzéses metodikát illékony puffer rendszer kidolgozásával sikerült elektrokinetikus injektáláshoz adaptálni, a reakció termékeinek megfelelő analízise érdekében.

3.2 A boronsav - lektin affinitás kromatográfia (BLAC)