2 Kísérleti rész
2.4 CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek
Munkám kisméretű peptidek kapilláris zóna elektroforetikus mobilitásra vonatkozó szerkezet-mobilitás összefüggéseinek vizsgálatára terjedt ki, az elválasztási körülmények szisztematikus változtatásával. Öt különböző, az elválasztást befolyásoló tényezőt, nevezetesen a hőmérsékletet (T [°C]), az alkalmazott feszültséget (U [kV]), a háttér elektrolit (BGE: background electrolyte) koncentrációját (CBGE [mM]) és a szerves adalékanyagok – mint az acetonitril (CACN [(V/V)%]) és metanol (CMeOH [(V/V)%]) – koncentrációját (CORG), választottuk ki elméleti megfontolások alapján, hogy az elektroforetikus migrációs tulajdonságokat befolyásoló különböző hatások széles skáláját lefedjék.
Az öt változó CZE elválasztási paraméter hatásának vizsgálata részletes kísérleti tervezést tett szükségessé, annak érdekében, hogy a kísérletek számát sikerüljön ésszerű korlátok között tartani anélkül, hogy az egyes paraméterek hatásait szem elől tévesztenénk. Minden egyes paraméterhez nagyjából öt különböző értékre volt szükség, hogy a kapott adatpontokra görbét illesztve a hatás természete értékelhető legyen. Így, az összes lehetséges eset (paraméterkombináció) számbavétele az említett öt paraméterhez, több mint 3100 kísérleti elválasztást eredményez. Sőt, figyelembe véve, hogy a reprodukálhatóság biztosításának érdekében minden elválasztásról indokolt három ismétlést kivitelezni, ez a szám tovább nő, 9000-et is meghaladva. Ezek a tények magától értetődően indokolták a bemutatott, alapvetően paraméter vezérelt megközelítés leszűkítését korlátozott számú peptidmintára. Mindazonáltal a mintákat gondosan kellett kiválasztani, hogy a különböző jellegű aminosavakat (apoláris, poláris, kationos, anionos és aromás jellegű oldalláncok) jól reprezentálják.
Az ismertetett körülmények vizsgálatához szükséges kísérletek hatalmas mennyisége a mérési pontok számának jelentős csökkentését tette szükségessé. Ezért két elkülönülő kísérleti tervet dolgoztunk ki. Így az első fázisban vizsgált független paraméterek a második kísérleti fázisból kihagyhatóvá váltak. Ezen felül külön figyelmet fordíthattunk két, egymással összefüggő, az elválasztást jelentősen befolyásoló tényezőre, nevezetesen a CBGE-CORG és T-CORG, melyek különös jelentőséggel bírnak.
A peptidmobilitás-modellezés irodalmának összefoglalása (1.3 fejezet; publikálva: 141) alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a korábbi munkák sem a szerves puffer
CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek
adalékok, sem az elektrolit koncentrációjának, sem pedig az elválasztás hőmérsékletének hatásait nem vizsgálták, annak ellenére, hogy ezeket a peptidanalízist jelentősen befolyásoló tényezőknek tekintik. Erre vonatkozólag a CBGE-CORG és a T-CORG komplex hatását vizsgálva – ahol különösen az utóbbi tarthat számot kiemelt érdeklődésre – egy további előremutató lépést sikerült tenni.
Következtetésként elmondható, hogy a kísérleti fázisokat különböző, többnyire független paraméterek változtatásával terveztük meg, különös hangsúllyal CBGE-CORG és T-CORG
hatásaira. A két jól elkülönülő kísérleti fázis így kerül jelölésre a továbbiakban is. Utolsó lépésként a két modellezési fázisban kapott adatokat és információkat megfelelő illesztést (közös paraméterek) alkalmazva egyesíteni kellett, lehetővé téve a még komplexebb elválasztási paraméterfüggés vizsgálatát.
2.4.1 Vegyszerek
Homogén aminosav-összetételű tripeptid mintákat alkalmaztunk a kísérletekhez. Az alanin (AAA), lizin (KKK) és tirozin (YYY) aminosavakból felépülő tripeptidek a Sigma -Aldrich-tól (St. Louis, MO, USA) kerültek beszerzésre. Az aszparginsav (DDD) és szerin (SSS) tripeptidjeit a Bachem Holding AG-tól (Bubendorf, Svájc) rendeltük. Az elektroozmotikus áramlás (EOF: electoosmotic flow) jelzésére szolgáló EOF markerként 0,01 (V/V)% dimetil-szulfoxidot (DMSO; Sigma-Aldrich) alkalmaztunk. A kapilláris kondicionálásához és a futtató pufferek pH-jának beállítására sósavat (Sigma-Aldrich) és nátrium-hidroxidot (Merck, Darmstadt, Németország) használtunk. A háttér elektrolitok pufferkomponenseként foszforsavat (Sigma-Aldrich), szerves adalékanyagként metanolt és acetonitrilt (Riedel-de Haen AG, Buch, Svájc) használtunk. Minden oldatot HPLC tisztaságú vízzel (Sigma-Aldrich) és kizárólag analitikai tisztaságú vegyszerekkel készítettünk.
2.4.2 Készülékek, műszerek
Minden kísérleti elválasztást 50 µm belső, 360 µm külső átmérőjű bevonatlan kvarc kapillárisban (bare fused silica capillary Polymicro Technologies, Tucson, AZ, USA), Beckman P/ACE MDQ kapilláris elektroforézis készüléken (Beckman Coultier, Fullerton, CA, USA) kiviteleztünk. A kapillárisok teljes hossza 40 cm, effektív elválasztási hossza az injektálástól a detektorig 10 cm volt. A detektálás 214 nm hullámhosszon történt. Az elválasztás hőmérsékletét 20-40°C között 5°C-onkénti lépésekkel változtattuk a T-CORG
fázisban, míg a CBGE-CORG kísérleti tervet állandó 25°C hőmérsékleten kiviteleztük.
2.4.3 Elválasztási körülmények
Az összeállított kísérleti terv kivitelezését megelőzően, a kísérleti reprodukálhatóság biztosításának érdekében, a megfelelő kapilláris kondicionálási módszer kidolgozása elengedhetetlen. Ez az időigényes feladat hosszas gyakorlati tesztelést igényelt a kiválasztott kapillárissal és pufferrel. A cél a leghatékonyabb kondicionálási módszer megtalálása, azaz különböző oldatokkal meghatározott ideig való mosás, a kapilláris belső falának tisztítására, az elektromos kettősréteg kialakítására, és ezáltal az ismételhető elválasztási környezet biztosítására. A végső kondicionálási módszert, mely vizes és nátrium-hidroxidos (1M) mosások sorozatát tartalmazza, a 8. ábra szemlélteti.
8. ábra: Kapilláris kondicionálás módszere (Beckman 32 Karat szoftver)
A kapilláris kondicionálással ellentétben, az elválasztási körülmények némileg eltérőek a két kísérleti fázisnál, ezért külön bekezdésekben kerülnek bemutatásra.
2.4.3.1 T-CORG elválasztási körülményei
A tripeptidek elektroforetikus tulajdonságainak vizsgálatára a méréseket 20, 25, 30, 35 és 40°C-on, foszforsavból készített 7,5-ös pH-jú pufferekkel végeztük. A futtató pufferek koncentrációja 30 mM volt, és öt különböző mennyiségű szerves adalékot (0, 5, 10, 15 és 20 (V/V)% MeOH) tartalmaztak. Két eltérő feszültség, 12 és 16 kV, alkalmazása mellett kiviteleztük az elválasztásokat.
A vizsgált tripeptideket úgy választottuk ki, hogy az öt fő aminosav karakterisztikát – apoláris (alanin tripeptid), poláris (szerin tripeptid), savas (aszparginsav tripeptid), bázikus (lizin tripeptid) és aromás (tirozin tripeptid) – képviseljék. Minden tripeptidet öt különböző pufferrel, két eltérő elektromos térerő hatására, öt különböző hőmérsékleten futtattunk meg, 50 kísérletet eredményezve tripeptid mintánként.
A minták nyomás (1 psi 4 másodpercig) hatására kerültek a kapillárisba injektálásra.
Minden kísérleti ponton három ismételt futtatást kiviteleztünk. A kapillárist minden ilyen tripla mérés között vízzel és 1 M NaOH-dal kondicionáltuk (lásd 8. ábra). A kapilláris minden
CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek
egyes mérés előtt a háttér elektrolittal került nyomás hatására (10 psi 5 percig) átmosásra. A tripeptidek mobilitásának kiszámításához minden mérés során referencia EOF marker is injektálásra került. Az elválasztási módszert – 12 kV feszültség hatására 40°C-on történő elválasztás esetén – részletesen, lépésenként az 5. táblázat szemlélteti.
Az elválasztás időtartamára külön figyelmet kellett fordítani, mivel ez jelentős eltéréseket mutat a különböző futások közt, és nehezen látható előre. Bár a futási idő becslését a rutin segíti, legtöbb esetben kísérletileg kellett meghatározni minden paraméter-kombinációhoz, hogy minden injektált minta ésszerű mérési idő mellett detektálásra kerüljön.
5. táblázat: T-CORG elválasztási módszer 40°C-on 12 kV-tal Esemény Értéke Időtartam Megjegyzés
Kapilláris hőmérséklet 40°C Kapilláris temperálása Mosás – Nyomás 10,0 psi 5,00 min Pufferes mosás
Várakozás 1,00 min Hőmérséklet stabilizálása
Injektálás – Nyomás 1,0 psi 4,0 sec EOF marker injektálása
Várakozás 0,05 min Kapilláris külsejének vizes mosása Injektálás – Nyomás 1,0 psi 4,0 sec Minta injektálása
Várakozás 0,05 min Kapilláris külsejének vizes mosása Szeparálás – Feszültség 12 kV 8,00 min Elválasztás (változó időtartam) Stop Data
2.4.3.2 CBGE-CORG elválasztási körülmények
Ebben a kísérleti fázisban öt különböző mennyiségű szerves adalékot tartalmazó (0, 10 és 20 (V/V)% MeOH és ACN), és öt eltérő koncentrációjú (10-50 mM) 7,5-ös pH-jú pufferrel, négy eltérő elektromos térerőség (100, 200, 300, 400 V/cm) hatására végeztük az elválasztásokat. A T-CORG kísérleti fázisban alkalmazott öt, különböző oldallánc karakterisztikájú aminosavból felépülő, tripeptid mintát használtuk ebben a kísérleti fázisban is.
Minden tripeptidet 25 különböző összetételű pufferrel, négy eltérő elektromos tér hatására analizáltunk, 100 kísérletet eredményezve tripeptidenként. Az injektálás 1 psi nyomás négy másodperces alkalmazásával történt. A reprodukálhatóság biztosítása érdekében három párhuzamos mérést kiviteleztünk. A kapillárist minden tripla mérés között kondicionáltuk (lásd 8. ábra). Az injektálások előtt a kapilláris a megfelelő pufferrel került átmosásra (10 psi, 5 min). Referencia EOF markerként DMSO-t injektáltunk (10 psi, 4 sec), a tripeptidek mobilitásainak számításához.
2.4.4 Kísérleti értékelés
Az elektroforetikus mobilitásokat a detektált migrációs időkből az alábbi egyenlet alapján számítottuk:
ahol νi az i-edik mintakomponens lineáris sebessége a kapillárisban, E az elektromos térerősség, LT a kapilláris teljes hossza, U az alkalmazott feszültség, LD a kapilláris effektív hossza (az injektálástól a detektálásig), ti az i-edik mintakomponens migrációs ideje és tEOF az EOF marker migrációs ideje.
A kísérleti reprodukálhatóság értékelésére, illetve az esetleges eltérések azonosítására statisztikai analízist végeztünk. Minden mérési tripletre kiszámítottuk a standard deviációkat (SD; σ), és összehasonlítottuk minden különálló mintacsoport esetén, azaz minden mintára (AAA, DDD, KKK, SSS, YYY) egy-egy csoportértéket kaptunk. Minden a csoport 90.
percentilisét (P90) meghaladó értéknél újra megvizsgáltuk. Egyedi eltérések esetén a migrációs időket ellenőriztük, és amennyiben megfelelőnek bizonyultak, a kiugró futás értékét eltávolítottuk az adattripletből. Súlyosabb esetekben, amikor egyetlen kiugró kísérleti elválasztás eltávolítása nem eredményezett alacsonyabb SD értéket, a teljes mérési triplet megismétlésre került.
A különböző minták reprodukálhatósági eltéréseinek értékelése, vagy a migráció mobilitási pontossággal való összevetése érdekében az eloszlás normalizált mérőszámára volt szükség.
A variációs együttható (CV, coefficient of variation) és a relatív standard deviáció (%RSD) megfeleltek e feltételnek. A CV a standard deviáció és az átlag hányadosával adható meg:
CV x
=σ (16)
ahol σ a standard deviáció és x az átlagérték. A %RSD értéke százalékban kerül kifejezésre és a variációs együttható abszolút értékeként definiálható:
%RSD 100 x σ⋅
= (17)
A %RSD értékét minden mintacsoportban, a migrációs időkre és a mobilitás értékekre egyaránt, kiszámítottuk a kapott értékek összehasonlítása érdekében.
CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek 2.4.4.1 A minták szerkezeti jellemzőinek meghatározása
Láthattuk a 1.3 fejezetben, hogy a QSPR modellek kidolgozásához nélkülözhetetlen a peptidek molekulaméretének (leggyakrabban molekulatömeggel kifejezve), és az adott pH-jú pufferben a töltésének az ismerete. A mintapeptidek méretének jellemzésére a molekulatömeg, mint szerkezeti jellemző választása kézenfekvő. A vizsgált peptidek molekulatömegeit az aminosav alkotóik molekulatömegeiből számítottuk:
( )
2A szakirodalomban leggyakrabban a Henderson-Hasselbach egyenlet ((19),(20) és (21) egyenletek) alapján számítják a töltést111,152. Itt a peptid effektív (nettó) töltése a polipeptid lánc ionizálható csoportjainak egymástól független töltéseinek összegeként adódik:
( ) összege, pKj a j-edik aminosav savas funkciós csoportjának disszociációs állandójának negatív tízes alapú logaritmusa, pKi az i-edik aminosav bázisos csoportjának disszociációs állandójának negatív tízes alapú logaritmusa.
A töltés az aminosav-szekvenciából kerül kiszámításra, az ionizálható csoportok disszociációs állandóinak ismeretében105. Általában adott aminosav ionizálható funkciós csoportjának disszociációs állandóját a peptid felépítésétől függetlenül konstans értéknek tekintik. Ugyanakkor a valóságban, különösen kisméretű peptidek esetén, az ionizálható funkciós csoportok nem függetlenek egymástól. A pK értékek nem csak az aminosavak minőségétől, hanem azok a peptid láncon való sztérikus elhelyezkedésétől is függenek105. A mintapeptidek töltéseinek számításához ezeket a megfontolásokat is igyekeztünk figyelembe
venni, hogy megfelelően precíz értékeket kapjunk. Ezért Mathematica7 (Wolfram Research Inc, Champaign, IL, USA) szoftver felhasználásával több számítási módszert is alkalmaztunk az irodalmi eredményekre alapozva111,153.
A peptidek pK értékeinek meghatározásához Pallas 3.5.1.1 pKalc (CompuDrug International Inc, Sedona, AZ, USA) szoftvert használtuk, mely a molekula szerkezeti képletéből nagy pontossággal képes becsülni, és számos esetben (a szoftver adatbázisában megtalálható molekuláknál) a számított értékek kísérleti titrálásokkal meghatározott értékekkel is validálhatók.
2.4.5 Modellezési módszerek
Átfogó irodalmi kutatómunkát végeztünk a molekuláris szerkezet, a CZE elválasztási paraméterek és az elektroforetikus mobilitás összefüggésék jellemzésére (az 1.3 fejezet foglalja össze, publikálva: 141). Az összefüggés modellezésére a kétváltozós szemi-empirikus (TVSE: two variable semi empirical) és a mesterséges neurális hálózat megközelítést egyaránt megvizsgáltuk. A szemi-empirikus modellek közül egyértelműen az Offord-modell ((3) egyenlet106) korrelációja bizonyult a legjobbnak az előtanulmányok alapján, ezért ezt választottuk, hogy a kísérleti adathalmazra megvizsgáljuk. Az ANN modellekkel szemben, melyeknél az inputok száma gyakorlatilag korlátlan lehet, az Offord-modell mindössze két paramétert – a töltés (Q) és molekulatömeg (M ) – tartalmaz. Így az Offord-modellel történő mobilitás-számításhoz, minden egyéb elválasztási paramétertől függetlenül, kizárólag a (3) egyenlet két input változójára van szükség. Ezzel szemben az ANN modellekhez minden további rendelkezésre álló paraméter – CMeOH, U, Q, M a T-CORG, illetve CBGE, CACN, CMeOH, U, Q, M a CBGE-CORG kísérleti fázisban – is alkalmazható bemenetként. A két kísérleti adatbázis egyesítésére is lehetőség van a közös input paraméterek (T, CBGE, CACN, CMeOH, U, Q, és M) alapján. Az ANN modellek inputjait és jellemzőit a 6. táblázat foglalja össze. Az input mátrix egy kivonatára (egy-egy kísérleti körülménnyel mintapeptidenként) a (22) egyenlet mutat példát:
CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek
A TVSE és az ANN modellekkel egyaránt a megadott inputparaméterek alapján történik a mobilitás értékek meghatározása. Eltérően az Offord-modelltől, az ellenőrzött tanulású (supervised training) ANN metodológia a kalibrációhoz további adatokat igényel, ami az egyes inputvektorokhoz tartozó célértékeket jelenti. A (23) egyenlet a (22) inputmátrixhoz tartozó célvektor, azaz az adott elválasztási körülmény mellett a megfelelő peptidekre kapott mobilitás értékek.
( ) ( 4 4 4 4 5)
_ 1, 06 10 4, 30 10 1, 28 10 1, 59 10 8,89 10
BGE ORG EXP
célokC C = µ = ⋅ − ⋅ − ⋅ − ⋅ − ⋅ − (23) Az ANN inputok és célok mátrixait egy Java program segítségével építettük fel, ami egy MSc diplomamunka154 keretében került megírásra. Minden kísérleti mobilitás értéket fel kellett dolgozni, összegyűjteni a megfelelő elválasztási paraméterekkel együtt, és beírni az input- és célmátrixok megfelelő helyeire.
6. táblázat: ANN modelljellemzők
Mint korábban jeleztem, a közvetlen összehasonlíthatóság és az eredmények kritikai értékelése érdekében, az Offord-féle TVSE és több ANN modellt is alkalmaztunk a kísérletileg kapott adatbázisokra (T-CORG, CBGE-CORG). Emellett a T-CORG adathalmazon két eltérő ANN tanulási (training) algoritmust is megvizsgáltunk, teljesítményük és CZE mobilitás modellezésre való alkalmazhatóságuk alapján. Majd a TVSE és az ANN módszerek legalkalmasabbikát a két adathalmaz uniójára is alkalmaztuk. A modellalkotás módszertanát az alábbiakban kísérleti adathalmazonkénti bontásban ismertetem részletesebben.
2.4.5.1 T-CORG modellezési fázis
A T-CORG adathalmazra három különböző modellezési megközelítést is vizsgáltunk, nevezetesen az Offord-modellt, egy momentum és adaptív tanulási arány alapú ANN-t (GDX:
gradient descent algorithm with variable learning rate) és egy ANN-t Levenberg-Marquardt tanulási algoritmussal (LM). A neurális hálózat modellek felépítésének sémáját a 8. ábra szemlélteti, míg a főbb paramétereiket a 7. táblázat foglalja össze. A rejtett réteg neuronjainál szigmoid transzfer függvényeket, míg az output réteg csomópontjainál lineáris függvényeket
alkalmaztunk. A mért mobilitás értékeket tanulási (60%), teszt (20%) és validálási (20%) halmazokra osztottuk. A 7. táblázat szerinti felépítésű ANN modelleket, a megfelelő tanulási algoritmusok alkalmazásával az adathalmazokon, Matlab (Natick, MA, USA) környezetben képeztük le.
9. ábra: T-CORG ANN modellek felépítése
7. táblázat: A T-CORG kísérleti fázis ANN modelljeinek paraméterei
Paraméter ANN GDX ANN LM
Max_epochs 5000 1000
Idő Korlátlan Korlátlan
Max_fail 20 6
Min_grad 1,00e-010 1,00e-010
MU 1,00e-003
MU_inc 10
MU_dec 0,1
MU_max 1,00e+010
Az ANN tanulási folyamat akkor került leállításra, amikor az iterációk száma elérte Max_epochs értékét, vagy a gradiens mértéke kisebb lett, mint Min_grad, illetve ha a tanulás időtartama meghaladta volna a megadott értéket (ez mindkét esetben korlátlan volt). A Max_fail a tanulás korai leállítására vonatkozó technika paramétere. A technika alkalmazása érdekében a rendelkezésre álló adatokat három részhalmazra osztottuk a fentebb leírtak szerint. A tanulási halmaz a gradiens számításához, a hálózat súlytényezőinek és eltéréseinek (bias) meghatározásához kerül felhasználásra. A tanulási folyamat során a hiba (error) a validációs halmazon követhető figyelemmel. A validálási hiba a tanulás kezdeti szakaszában általában a tanulási halmaz hibájával együtt csökken. Ugyanakkor, ha a hálózat túlilleszti (overfitting) az adatokat, a validálási halmaz hibája jellemzően növekedni kezd. Ha a validálási hiba egy meghatározott számú iteráción keresztül (Max_fail) növekszik, a tanulási folyamat leáll, és a legkisebb validálási hibához tartozó súlytényezők és eltérések kerülnek kiválasztásra. A teszt halmaz hibája nem került a tanulás során felhasználásra. Ezt a különböző modellek összehasonlításához alkalmaztuk. Ugyanakkor hasznosnak bizonyult a teszt halmaz hibájának ábrázolása a tanulási folyamat során. Ha a teszt halmaz hibája jelentősen eltérő számú iterációs ciklusnál ér el minimumot, mint a validálási halmaz hibája, az a kísérleti adathalmaz nem megfelelő felosztásáról árulkodik155. A korai leállítási technikát a modell általánosíthatóságának biztosítása érdekében alkalmaztuk. Korai leállítással a
CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek
validálási halmaz kiválasztása is fontos, mert ennek jól kell reprezentálnia a tanulási halmaz minden pontját. Ezért a tanulást számos különböző kezdeti feltétellel is elvégeztük, a robosztus hálózati teljesítmény garantálására.
A GDX tanulási algoritmus az új súlyokat és eltéréseket minden olyan esetben elveti, amikor az új hiba a korábbit egy előre meghatározott mértékben (Max_perf_inc) meghaladja, és a tanulási arányt LR_dec értékkel megszorozva lecsökkenteti. Egyébként az új súlyok elfogadásra kerülnek. Amennyiben az új hiba kisebb a korábbinál, a tanulási arány LR_inc értékével való szorzás eredményeként kerül növelésre. Az MC momentum állandót (momentum constant) 0 (nincs momentum) és 1 közeli értékek (nagy momentum) közé állítottuk. Az 1 momentum állandóval rendelkező hálózat a lokális gradiensre teljesen érzéketlen, és ezért nem eredményez megfelelő tanulást.
MU a Levenberg-Marquardt algoritmus kezdeti értéke. Ez az érték teljesítményfüggvény-csökkenéssel járó lépéseknél MU_dec értékével kerül megszorzásra, míg a teljesítményfüggvény növekedésekor MU_inc értékével szorzódik. Ha MU értéke meghaladta MU_max értéket, az algoritmus leállításra került155.
2.4.5.2 CBGE-CORG modellezési fázis
Erre az adathalmazra kétváltozós Offord-féle és Levenberg-Marquardt tanulási algoritmusú ANN modelleket alkottunk. A neurális hálózat modellek fő paramétereit a 6. táblázat foglalja össze. A rejtett réteg neuronjainál szigmoid transzferfüggvényeket alkalmaztunk, az output réteg csomópontokhoz lineáris függvényeket. A kísérleti adatbázist tanulási (70%), teszt (15%) és validálási (15%) halmazokra osztottuk. A modell Matlab környezetben került kidolgozásra. A tanulási algoritmus paraméterei megegyeztek a T-CORG adathalmazra alkalmazott LM-ANN modellnél alkalmazottakkal (7. táblázat).
2.4.5.3 A T-CORG és CBGE-CORG kísérleti adatbázisok egyesítése
Mindkét input paraméter halmazt ki kellett bővíteni, hogy kísérleti adathalmazok egyesítésével mobilitás becslő ANN modellt alkothassunk. A T-CORG inputjait a CBUF
(30mM) és CACN (0 (V/V)%) paraméterek állandó értékeivel, míg a CBUF-CORG inputjait a hőmérséklet 25°C konstans értékével egészítettük ki.
Az egyesített adatbázisra Levenberg-Marquardt tanulási algoritmusú ANN modellt dolgoztunk ki. A neurális hálózat modell főbb paramétereit a 6. táblázat foglalja össze. A mobilitás adatbázist három részre – tanulási (60%), teszt (20%) és validálási (20%) halmazokra – osztottuk. A rejtett réteg neuronjaira szigmoid transzfer függvényeket, az output réteg csomópontjaira lineáris függvényeket alkalmaztunk.
A LM algoritmus alapú tanulási folyamatot és neurális hálózat modellt Matlab környezetben alkottuk meg. A 8. táblázat foglalja össze a tanulási algoritmus paramétereit.
8. táblázat: Az egyesített adatbázis LM-ANN modelljének paraméterei
Paraméter ANN LM
Max epochs 1000
Idő Korlátlan
Validation checks 12
Min grad 1,00e-015
MU 1,00e-003
MU increment 10 MU decrement 0,10
MU max 1,00e+010
Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez
3 Eredmények
3.1 Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél