• Nem Talált Eredményt

Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

2 Kísérleti rész

3.4 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

3.4.1 Kísérleti eredmények

Mindösszesen 1650 körüli kísérleti CZE futás került kivitelezésre a T-CORG és CBGE-CORG

fázisokban. A 21. ábra jellemző CZE mintákat mutat be a tripeptid minták keverékének (a minta az öt tripeptid keverékét és az EOF markert tartalmazta) elválasztásán a T-CORG

kísérleti fázisból. Az ábrán bemutatott elválasztásokat különböző hőmérsékleten futtattuk, 15% metanolt tartalmazó háttér elektrolittal, 12 kV feszültség hatására. Jól látható, hogy a hőmérséklet növelésével a migrációs idők és a csúcsfelbontás csökkenést mutatnak. A tripeptid minták migrációs sorrendje a következőként adódott: lizin (KKK), alanin (AAA), tirozin (YYY), szerin (SSS) majd aszparginsav (DDD) aminosavakból felépülő tripeptid csúcsok (a zárójelben látható mintajelöléseket az aminosavak egybetűs rövidítéseiből az ábrán is feltüntetettük). A lizin tripeptid csúcsa az EOF markert is megelőzte, következésképpen itt a mobilitás értéke negatívnak adódik.

Az elektroforetikus mobilitás és az elektroozmózis sebessége egyaránt növekedést mutat a hőmérséklet emelésével a közeg viszkozitásának változása következtében. Így hőmérséklet fő hatása elektroozmotikus áramlás mellett az analízis idő lecsökkenése. A hőmérséklet 10°C-kal való növelése az EOF-t közel 20%-kal növeli163. Mivel az EOF irányával ellentétesen vándorló mintakomponensek mobilitásait szintén csökkenti a hőmérséklet emelése, az analízis idejének csökkenése még jelentősebb. Ugyanakkor nem szabad elfelejteni, hogy az analízisidő magasabb hőmérséklet hatására történő csökkenésében rejlő lehetőségek kiaknázása, a rendszer hatékony termosztálását igényli a nagyobb mennyiségben képződő Joule-hő elvezetésére. Másrészt az analízisidő csökkenése a felbontás

21. ábra: T-CORG kísérleti fázis elektroferogramjai

romlásával jár együtt163-164. A hőmérséklet hatását a tripeptid minták elválasztására a 21. ábra szemlélteti.

A CBGE-CORG kísérleti fázisra vonatkozóan a 22. ábra mutat néhány szemléletes példát a tripeptid mintakeverék elválasztására 10 mM koncentrációjú foszfát pufferrel. A puffer metanol tartalmának emelése a csúcsfelbontás romlását eredményezte az elválasztás idejének csökkenése mellett. A 20 (V/V)% metanolt tartalmazó pufferrel kapott elektroferogramon a mintacsúcsok erősen átlapolnak, ami az azonosításukat jelentősen megnehezíti. Mindazonáltal a migrációs sorrend a korábban leírthoz képest nem változott.

Kapilláris elektroforézisnél számos adalékot alkalmaznak az elválasztó rendszer

fizikai-kémiai tulajdonságainak megváltoztatására165. A szerves

oldószereket a puffer elektrolit polaritásának és viszkozitásának módosítására használják. Ez mind az elektroozmotikus áramlásra, mind a minták elektroforetikus mobilitására

hatással van. A puffer elektrolit viszkozitásának növekedése az elektroozmotikus áramlás sebességének csökkenésével jár163. A puffer szerves oldószer tartalma a pH-t is befolyásolja.

A szerves oldószerek elektroforetikus mobilitásra gyakorolt összetett hatásainak modellezése kihívást jelentő feladat. Kísérleti eredményeink alapján elmondható, hogy mind a metanol, mind pedig az acetonitril csökkenti az alkalmazott mintapeptidek elektroforetikus mobilitását, és a mobilitások különbségeit. Ennek következtében a felbontás is romlik. A metanol koncentrációjának hatását a tripeptid minták elválasztására a 22. ábra mutatja be.

3.4.2 Statisztikai értékelés

A kondicionálás során fellépő nyomás problémák, a kapilláris belső falának hibája, a kapilláris végeinek sérülése okozta hibás futásokat eltávolítottuk a kísérleti adathalmazból, és elvégeztük a megmaradt futások deviációinak statisztikus elemzését. A T-CORG kísérleti fázis adatainak relatív standard deviációjának (%RSD) elemzését a kiugró értékek eltávolítása és az erősen szóró eredmények megismétlése után a 10. táblázat foglalja össze.

22. ábra: CBGE-CORG kísérleti fázis elektroferogramjai

Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

10. táblázat: A T-CORG kísérleti fázis RSD analízise

%RSD Migráció Mobilitás

EOF AAA DDD KKK SSS YYY AAA DDD KKK SSS YYY

Átlag 0,504 0,426 1,684 0,634 0,447 0,398 1,579 0,537 1,492 1,178 1,463 Min 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,265 0,000 0,000 0,131 0,000 Max 2,343 3,415 4,997 1,753 1,971 2,107 4,051 2,074 4,108 4,620 6,157 P85 0,820 0,733 3,052 0,996 0,724 0,624 2,508 0,849 2,592 2,237 2,450 P95 1,236 0.958 4,063 1,542 1,028 0,843 3,143 1,185 3,022 2,926 3,480

A CBGE-CORG kísérleti fázis migrációs időinek átlag %RSD értékei 0,844, 1,194, 4,444, 0,819, 0,926 és 0,955 voltak az EOF, AAA, DDD, KKK, SSS és YYY esetében. A mobilitások átlagos %RSD értékei 3,052, 0,830, 2,671, 1,208 és 1,695 az AAA, DDD, KKK, SSS és YYY mintákkal. A migrációs idők és mobilitás értékek pontosságának összehasonlítása meglepő módon alacsonyabb relatív standard deviációkat mutatott a migrációs időkre. A mobilitás értékek deviációit vártuk alacsonyabbnak, mivel az EOF marker hatását – az EOF reprodukálhatóságának tökéletlenségét – tételeztük fel a csúcsok egymáshoz képest való eltolódásának okaként, ami mind az EOF, mind pedig a minták csúcsainak eltolódását eredményezi. Másrészről, a mobilitás meghatározásához két szórással rendelkező értéket szükséges számításba venni, míg a migrációs időknél értelemszerűen csak egyet. Nyilvánvalóan kiváló reprodukálhatóságot sikerült a teljes kísérleti fázis során elérni, így a mobilitás-számítás nem eredményezhette a pontosság javulását, hanem némileg nagyobb

%RSD értékeket eredményezett.

A %RSD értékek mélyreható elemzése a paraméterfüggő szabályszerűségek feltárása érdekében azt mutatta, hogy a CACN növelése a %RSD növekedésével jár együtt (23. ábra).

Erre a hatásra már a kísérleti fázis kivitelezése alatt fény derült, hisz a nagyobb acetonitril tartalmú pufferekkel szembetűnő volt a futások közti eltérés. A további vizsgálatok azt mutatták, hogy a magas acetonitril koncentráció a kapillárisok külső polimer borítását is károsítja (24. ábra), és így a kapillárisba levegőbuborék bejutásának esélyét nagyban növeli.

Így a magas acetonitril tartamú pufferekkel végzett futtatásokat különös odafigyeléssel volt szükséges kivitelezni a kapilláris végeinek rendszeres mikroszkópos ellenőrzésével. A %RSD értékelése más paraméterfüggő szabályszerűséget nem mutatott.

A hibás futások kiszűrése és a szükséges ismételt kísérletek elvégzése után a T-CORG, CBGE-CORG és az egyesített prediktív modellezéshez 710, 1783 és 2493 adatpont állt rendelkezésre.

23. ábra: CACN (V/V%) vs %RSD 16kV alkalmazott feszültség mellett

24. ábra: Acetonitril adalék hatására károsodott kapillárisborítás

mikroszkópos felvétele

3.4.3 Mintapeptidek töltésszámítása

Általában a peptidek töltéseit a disszociációra képes csoportokat egyenként tekintve számítják. Így az általános i-edik savas csoportra az egyensúly a következőképp írható fel166:

1 [ ] [ ]

A negatív töltés moláris frakciója az i-edik savas csoportra alapján az alábbi kifejezéssel írható fel167-168:

Következésképpen a csoportok disszociációját egymástól függetlenül kezelve a negatív töltések teljes mennyisége (Nt) a fenti kifejezés minden savas csoportra való összegzésével adódik:

Ugyanakkor a j-edik bázisos funkciós csoportra az egyensúly az alábbiak szerint módosul:

1 [ ] [ ]

Így a csoportra a pozitív töltés moláris frakciója az alábbi kifejezéssel írható fel:

Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

Így a pozitív töltések összes mennyisége a moláris frakciók szerinti összegzéssel kapható meg:

A peptid Q töltése adott pH-n a pozitív és negatív töltések összegzésével kapható meg:

t t

Q= −P N (30)

A fenti kifejezés a peptid töltésére i+j független protonálható funkciós csoportra vonatkozik, a Stokes-féle rádiuszt állandónak feltételezve a különböző töltésű formák esetén166.

Ugyanakkor a disszociációra képes csoportok, különösen kis peptidek esetén, nem tekinthetők függetlennek egymástól. A pK értékek nem csak a protonálható funkciós csoporttal rendelkező aminosav minőségétől függenek, hanem a szomszédos aminosav oldalláncok protonálódásra képes csoportjaitól, illetve a peptidlánc sztérikus tulajdonságaitól is105.

Ezeket a megfontolásokat figyelembe véve a tanszékünkön multiprotikus ionok ionkromatográfiás vizsgálata során alkalmazott egyenletrendszer alkalmazása kínálkozott alternatívának150. Az egyszeresen (i=1), kétszeresen (i=2), …, m-szeresen (i=m) protonált formák φ moláris frakciói a következőképp írhatók fel:

1

ahol Kn az n-edik protonálódásra képes csoport protonálódási állandója.

A teljesen disszociált formára a fenti egyenlet az alábbiak szerint módosul:

0

A tripeptid teljes töltése adott pH-n így az alábbi kifejezéssel számítható:

0

ahol Qi az i-szeresen protonált formához tartozó töltés értéke.

A tripeptidek töltéseit a (30) és a (33) egyenlet alapján egyaránt kiszámítottuk a Pallas pKalc szoftverrel kapott pK értékek alapján. A tripeptidek mólarányeloszlás (φ vs pH) függvényeit, számított töltéseit a pH függvényében mindkét fent ismertetett számítási módszerrel és az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezeteit a 25-29. ábra mutatja.

Jól látható a diagramokon, hogy a két módszerrel kapott töltés értékek a pH függvényében nagyfokú egyezést mutatnak. Eltérés a görbék lefutásában csak a több egymáshoz közel eső pK értékkel rendelkező funkciós csoportot tartalmazó – aszparginsav (26. ábra), lizin (27.

ábra) és tirozin (29. ábra) aminosavakból felépülő tripeptid – minták esetén tapasztalható.

26. ábra: Az aszparginsav aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.

25. ábra: Az alanin aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.

Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

28. ábra: A szerin aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.

27. ábra: A lizin aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.

A fenti diagramok (25-29. ábra) vizsgálatából jól látható, hogy az elválasztásokhoz alkalmazott 7,5-ös pH-n a kétféle számítási módszer mind az öt mintamolekula esetén azonos töltés értékeket eredményez. Így a módszer megválasztása a megalkotott modellek pontosságát nem befolyásolja.

Az alkalmazott pH-n a mintamolekulák töltéseit és töltéssel korrigált molekulatömegeit a 11. táblázat foglalja össze.

3.4.4 Modellezési eredmények

A következőkben a modellezési eredményeket a megfelelő kísérleti fázisok szerint külön kerülnek ismertetésre. Végül a T-CORG és CBGE-CORG kísérleti fázisok egyesítése kerül bemutatásra.

3.4.4.1 T-CORG kísérleti adatbázis modellezési eredményei

Az 1.3.1 fejezetben bemutatott szemi-empirikus modellek nem képesek az elválasztási körülmények változásainak többségét számításba venni. Ez a magyarázata, hogy az Offord-modell a pufferösszetétel változását, a különböző futási hőmérsékleteket, illetve az összefüggés esetleges nem-lineáris természetét figyelmen kívül hagyva, nem képes megfelelő

29. ábra: A tirozin aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.

11. táblázat: A tripeptidek Q és M értékei a kísérleti körülmények mellett

Minta Q M

AAA -0,22 231,05 DDD -3,18 360,08

KKK 2,77 405,38

SSS -0,6 278,65

YYY -0,52 507,00

Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

pontosságú modellezési teljesítményt nyújtani. A 12. táblázat mutatja be a modellekkel kapott és a kísérleti mobilitás értékek korrelációs együtthatóit, a teljes és egyszerűsített (szerves adalékanyagok változásait nem tartalmazó) adathalmazokra egyaránt. Az Offord-modell rugalmatlan viselkedését a 30. ábra által bemutatott korrelációs diagram jól szemlélteti, vízszintes vonalakat mutatva az egyes tripeptid mintákhoz (csak négy különíthető jól el, mivel a SSS és YYY minták átfednek az ábrán). Ennek oka, hogy mindössze Q és M input paramétereket figyelembe véve az olyan hatások kezelésére, mint a hőmérséklet vagy szerves adalék mennyisége, a modell nem képes.

Ezzel szemben, az ANN modellek képesek voltak a változó futási hőmérséklet és szerves adalék anyagok (feltételezhetően nem-lineáris) hatásainak kezelésére, igen jó prediktív teljesítményt eredményezve. Az LM-ANN modellel kapott és a kísérleti mobilitások korrelációját a 31. ábra mutatja be. Az ANN megközelítés kiváló alkalmazhatóságát a 12.

táblázat is szemléletesen demonstrálja.

12. táblázat: Korrelációs együtthatók

Modell T-CORG CBGE-CORG

TVSE Offord szerves adalék nélkül 0,9415 0,9417

TVSE Offord 0,9209 0,9082

ANN GDX (tanulási, teszt, validálási) 0,9976 - ANN LM (tanulási, teszt, validálási) 0,9990 0,9961

Bár a GDX és LM algoritmusok egyaránt nagyon jól adaptálhatónak bizonyultak az adott adathalmazhoz, a tanulási teljesítményük eltéréseket mutatott. A GDX algoritmus a tanulási paraméterek fárasztó beállítását igényelte a LM algoritmussal kapottnak megfelelő korreláció elérése érdekében. Sőt a GDX tanulása 1443 iterációt igényelt, szemben a 14 iteráció után leállított LM tanulási folyamattal, mely némileg még jobb korrelációs értékeket is adott. Így a

30. ábra: Az Offord-modell korrelációs diagramja (T-CORG)

31. ábra: Az LM-ANN modell korrelációs diagramja (T-CORG)

LM tanulási módszert fogadtuk el a bemutatott adatokhoz alkalmasabbnak, és így a következő modellezési feladatokhoz is ezt használtuk.

A 12. táblázat mutatja a GDX és LM tanulási algoritmusú ANN-ekkel kapott korrelációs értékek összehasonlítását. A LM algoritmus tanulási teljesítményét a 32. ábra szemlélteti. Az iteráció 14 tanulási ciklus után leállításra került, mivel a validálási halmaz hibája elérte a minimumát, és a további ciklusok a modell túltanulását okozták volna.

32. ábra: Az LM-ANN tanulási-teljesítmény grafikonja (T-CORG)

33. ábra: YYY minta predikciós diagramja 12 kV elválaszásokra (T-CORG)

34. ábra: 15 (V/V)% MetOH tartalmú elektrolittal 12 kV elválasztások predikciós diagramja az öt mintapeptidre

(T-CORG)

Az LM tanulású ANN modell prediktív képességét a 33. ábra és 34. ábra szemlélteti, ahol a kísérleti mobilitások körökkel, a számított értékek folytonos vonalakkal vannak jelölve. A tirozin aminosavból álló tripeptid példáján keresztül mutatja be a 33. ábra 12 kV feszültség

Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

alkalmazásával, különböző összetételű pufferekkel, változó hőmérsékleten végzett elválasztások esetén, míg a 34. ábra a hőmérséklet hatásaira helyezi a hangsúlyt 15 (V/V)%

metanolt tartalmazó pufferrel 12 kV feszültség hatására kivitelezett elválasztások esetén minden mintapeptidre.

3.4.4.2 CBGE-CORG kísérleti adatbázis modellezési eredményei

A várakozásoknak megfelelően az Offord-modell nem nyújtott erre az adathalmazra sem pontos modellezési teljesítményt, mivel

sem a futtató puffer összetétel-változásainak hatásait, sem pedig a tanulmányozott összefüggés esetleges nem-lineáris karakterisztikáit nem képes kezelni. A becsült és kísérleti mobilitások közti korrelációs együtthatókat a 12. táblázat foglalja össze, a teljes és egyszerűsített (szerves adalékok nélküli) adathalmazokra egyaránt. A szerves adalék nélküli adathalmaz jelentősen jobb korrelációs

együtthatója, jól szemlélteti az Offord-modell tökéletlenségeit a vizsgált kísérleti körülmények közt. Következésképpen a CACN és CMeOH – két leginkább befolyásoló paraméter – változásának kiszűrése a megfelelő korrelációs együtthatók látványos javulását eredményezte.

Az alkalmazott LM-ANN modell ezzel szemben alkalmas volt a puffer koncentráció-változásainak és szerves oldószertartalmának (feltételezhetően nem-lineáris) hatásainak kezelésére, igen jó prediktív teljesítményt eredményezve. A becsült és kísérleti mobilitások korrelációs eredményeit 35 tanulási ciklus után a 35. ábra mutatja be az összes különböző tripeptid mintára. Az ANN megközelítés kiváló alkalmazhatóságát, a 12. táblázat korrelációs értékeit összevetve, szemléletesen sikerült demonstrálni. A 36. ábra és 37. ábra mutatja az ANN prediktív képességét, a kísérleti mobilitásokat körökkel, a számított értékeket folytonos vonalakkal jelölve. A 36. ábra lizin aminosavakból felépülő tripeptid mintára szemlélteti a prediktív teljesítményt különböző összetételű pufferekkel, míg a 37. ábra a különböző pufferkoncentrációk hatásait mutatja be az összes mintakomponens elektroforetikus mobilitására.

35. ábra: LM-ANN modell korrelációs diagramja (CBGE -CORG)

36. ábra: A KKK minta predikciós diagramja 12 kV-tal történő elválasztásoknál (CBGE-CORG)

37. ábra: Predikciós diagram 12 kV-tal történő elválasztásokra 10 (V/V)% metanolt tartalmazó pufferekkel (CBGE-CORG)

3.4.4.3 A CBGE-CORG és T-CORG adatbázisok egyesítése

A majd 2500 kísérleti mobilitás értéket tartalmazó nagymennyiségű adat modellezése különös gondosságot igényelt. A tanulási paraméterek módszeres beállítása képessé tette az alkalmazott LM-ANN modellt az összes vizsgált kísérleti jellemző – azaz T, CBUF, CACN, CMeOH, U, Q, és M – figyelembe vételére, kiváló prediktív képességről téve tanúbizonyságot.

38. ábra: A LM-ANN tanulási teljesítménye az egyesített adatokkal

A legjobb korrelációs együttható értéket (r2=0,9972) a tanulási folyamat 152 iterációs ciklusa után kaptuk. A LM algoritmus tanulási teljesítményét a 38. ábra mutatja be, míg a korrelációt a 152 tanulási ciklus után számított és a kísérletileg meghatározott mobilitás értékek között a 39. ábra szemlélteti. További iterációs ciklusokkal a validálási halmaz hibája

Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál

nőni kezdett, a modell túltanulását okozva, ami igazolta, hogy jól sikerült megválasztani a leállítás idejét.

A 40. ábra tovább szemlélteti az egyesített adathalmazra alkalmazott ANN modell prediktív teljesítményét, ahol a körök jelölik a kísérleti, a folytonos vonalak a modellel kapott mobilitásokat. Az ábra a metanol koncentráció változásának hatásait mutatja a mintapeptidek mobilitásaira. Mivel a CMeOH paraméter mindkét adathalmazban (T-CORG és CBGE-CORG) szerepet játszott, így a 40. ábra a két kísérleti adathalmaz unióját tartalmazza.

39. ábra: A LM-ANN modell korrelációs diagramja az

egyesített adathalmazra 40. ábra: A predikciós diagram az egyesített adathalmazra 12 kv feszültséggel 30 mM koncentrációjú pufferrel

3.4.5 Következtetések

A peptidek elektroforetikus mobilitása és töltöttségi állapotuk, méretük (hidrodinamikai sugárral, molekulatömeggel vagy aminosav alkotók számával kifejezve) és alakjuk (az oligo- és polipeptid láncok konformációja) között a megfelelő korreláció elérése továbbra is kihívást jelentő feladat. A hagyományos szemi-empirikus QSPR modellek hiányosságainak leküzdésére kétféle stratégia áll rendelkezésre. Egyrészt a kétváltozós modellek további peptid paraméterekkel való kiegészítése, hogy a modell leíró képességét, működési tartományát a szélesebb skálájára kiterjeszthessék. Másrészt nem-lineáris modellezési módszerekkel, mint a mesterséges neurális hálózatok, pontosabb és robosztusabb modellek megalkotása. A peptidek elektroforetikus mobilitásának előrejelzésére az elválasztási körülmények függvényében újszerű, alapvetően paraméter vezérelt megközelítést alkalmaztunk kisszámú, egyszerű, reprezentatív mintával létrehozott kiterjedt kísérleti adatbázis alapján. Külön figyelmet fordítottunk az olyan, korábbi modellezési munkák során még nem vizsgált, elválasztási körülmények hatásaira, mint a háttérelektrolit szerves adalékanyag tartalma és az elválasztás hőmérséklete. A gépi intelligencia módszerek lineáris modellezési technikákkal szemben

mutatott kiváló alkalmazhatósága és prediktív teljesítménye a peptidek szerkezeti jellemzői és elektroforetikus mobilitásuk között fennálló nem-lineáris összefüggést igazolja.

Összefoglalás

4 Összefoglalás

A komplex szénhidrátok nagyhatékonyságú kapilláris elektroforetikus elválasztása gyorsan fejlődő terület. Doktori dolgozatom első felében e területen elért eredményeket foglaltam össze. A multikapilláris formátumú alkalmazás a glikoziláció változásainak nagy áteresztőképességű elemzését teszi lehetővé, egyrészt az oligoszacharid eloszlás természetének és/vagy mértékének (profilozás/profiling) vizsgálatával, másrészt exoglikozidáz alapú emésztéses (szekvenálás) analízisével. Mivel a cukrok csak kivételesen tartalmaznak töltést hordozó, kromofór vagy fluorofór csoportokat, elektroforetikus elemzésük megfelelő jelölési módszert követel meg. A 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonát (APTS) a célra az egyik leggyakrabban alkalmazott reagens, mely lehetővé teszi a fluoreszcens detektálást látható kék fényt emittáló LED hatására. Az APTS jelölés az elektroforetikus elválasztáshoz szükséges töltést is biztosítja a mintamolekuláknak.

Ugyanakkor a derivatizációs reakció kiváló kihozatalához szükséges APTS nagy moláris feleslege a reakcióelegyben az injektálás és elválasztás során komoly nehézségeket eredményez. Az injektálás során kifejtett zavaró hatása mellett, az oldatban maradó konjugálatlan jelölőanyag a kisméretű oligoszacharidok kimutatását is megnehezíti, mivel gyakran ezek az elválasztás során együtt vándorolnak egy túltelített átlapoló elektroforetikus csúcsot eredményezve. Munkám során a jelölő anyag kapilláris elektroforetikus elemzést megelőző három mintaelőkészítési módszert értékeltem. Mindhárom módszer képesnek bizonyult az APTS eltávolítására, nagyobb érzékenységet eredményezve a vizsgálni kívánt jelölt szénhidrátok analízise során, azonban a DPA-6S normál fázisú poliamid kromatográfiás állófázist tartalmazó pipetta hegyek kimagaslóan a legjobb hatásfokot eredményezték.

A humán szérum glikozilációs profiljának vizsgálatához nélkülözhetetlen mintaelőkészítési feladatot, a minta glükóz tartalmának eltávolítását, ultraszűréssel sikerült hatékonyan megoldani. Az exoglikozidáz emésztésen alapuló szénhidrát elemzéses metodikát illékony puffer rendszer kidolgozásával sikerült elektrokinetikus injektáláshoz adaptálni, a reakció termékeinek megfelelő analízise érdekében.

A munka folytatásaként a hőmérséklet hatásait vizsgáltam meg a glikoproteinek boronsav - lektin affinitás kromatográfiás (BLAC: boronic acid - lectin affinity chromatography) izolálásának és dúsításának hatékonyságára. Búzacsíra agglutinin (WGA: wheat germ agglutinin) és m-aminofenil-boronsav (boronsav) tartalmú állófázisokat vizsgálva egyedileg és kevert formában, integrált 96-os mikrotiter plate hűtő/fűtő egységgel szerelt automatával.

Ribonukleáz B és tripszin inhibitor modell proteinek glikoaffinitás kromatográfiás dúsítását

vizsgáltam nem glikozilált mioglobin (semleges) és lizozim (bázikus) fehérjék jelenlétében széles (5-65°C) hőmérséklettartományon.

Az eredmények alapján meghatároztam a mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoprotein izoláció kihozatalának hőmérsékleti optimumát. Ugyanakkor nagy mennyiségű lizozim jelenlétét tapasztaltam az m-aminnofenil-boronsav tartalmú állófázisok elúcióiban, rávilágítva a negatív töltésű állófázis és a pozitív töltésű fehérje közt az alkalmazott pH-n fellépő ioncserés mechanizmusra. Másrészt, magas hőmérsékleten (65°C) nem specifikus kölcsönhatások érvényesültek az agaróz hordozóval, amit a mioglobin jelenléte igazolt az

Az eredmények alapján meghatároztam a mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoprotein izoláció kihozatalának hőmérsékleti optimumát. Ugyanakkor nagy mennyiségű lizozim jelenlétét tapasztaltam az m-aminnofenil-boronsav tartalmú állófázisok elúcióiban, rávilágítva a negatív töltésű állófázis és a pozitív töltésű fehérje közt az alkalmazott pH-n fellépő ioncserés mechanizmusra. Másrészt, magas hőmérsékleten (65°C) nem specifikus kölcsönhatások érvényesültek az agaróz hordozóval, amit a mioglobin jelenléte igazolt az