• Nem Talált Eredményt

Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására

Ismerve a növényi lektinek nagy specifikusságát, nem is lehet meglepő, hogy immobilizált formáik egyre elterjedtebbek a glikoproteinek analízisében. A gyakori lektin immobilizációs technikák a reverzibilis nem-kovalens kötésektől a különböző állófázisokhoz való kovalens kapcsolásokig terjednek. Ebben a fejezetben a lektinek immobilizálási technikáit tekintem át különböző állófázisokon, lektin affinitás kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiás és elektroforetikus bioszeparációs módszerekhez.

A glikánok a komplex sejtszerveződések közvetítői, melyek jellemzőek a sejt típusára és életszakaszára. Minden élő szervezet tartalmaz változatos szénhidrát szerkezetekkel borított sejteket44, ezért a glikoprotein-analízis a tudományos érdeklődés középpontjában áll. A lektinek nem-immun eredetű fehérje molekulák, melyek szénhidrátokkal specifikus kölcsönhatásokba lépnek anélkül, hogy módosítanák őket. A legtöbb lektin célzottan kapcsolódik a cukor egységekhez, mint az neuraminsav (NeuNAc), N-acetil-glükózamin (GlcNAc), galaktóz, fukóz vagy mannóz45. A növényi magvakban nagymennyiségű lektin található, ezért leggyakrabban innen izolálják őket. Feltételezhetőleg a csírázás folyamatában és a magok túlélésében egyaránt fontos szerepük van. Ugyancsak feltételezik, hogy a növényi sejtek felületén a glikoproteinek megkötésében is részt vesznek46. Továbbá állati szervezetekben is jelen vannak lektinek, melyek például a glikoproteinek kiválasztásának szabályozásában játszanak szerepet47. Sőt számos egyéb biológiai funkciót ellátnak a sejtadhézió szabályozásától, a glikoprotein szintézisen át, különböző vérfehérjék szintjének szabályozásáig48. Ugyancsak ismert, hogy a lektinek fontos szerepet töltenek be az immunrendszerben, mivel képesek felismerni a patogénekre jellemző szénhidrátokat49.

A szénhidrát felismeréséhez általában megfelelő konformációra van szükség, és gyakran a szomszédos cukoregységek minősége is meghatározó a kölcsönhatás szempontjából. A legtöbb irodalmi forrás feltételezi, hogy a lektinek elsődlegesen monoszacharidokkal alakítanak ki kötéseket, ugyanakkor tudott, hogy összetett szénhidrátokkal egy nagyságrenddel nagyobb affinitást mutatnak50. Gyakran fém-szénhidrát kölcsönhatások is fontos szerepet játszanak a lektinek megkötési folyamatában. Például a mannóz-kötő lektinek krisztallográfiás vizsgálatai kimutatták, hogy a szénhidrát megkötés csak Ca2+ ionok

Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására

jelenlétében játszódik le, míg más típusú lektinek a megfelelő szubsztráttal fémionok hiányában is képesek reagálni51-52.

A bioelválasztásoknál leggyakrabban használt lektinek összefoglalását az 1. táblázat tartalmazza53. Ahogy korábban is utaltam rá, lektinek nem kizárólag növényekben fordulnak elő. Néhány állati lektint már a növényi lektinek előtt felfedeztek, azonban ezeket szénhidrátkötő fehérjékként már jó ideje nem alkalmazzák54.

Ahogy az 1. táblázatban is látható különböző glikoproteinek és glikopeptidek izolálásához a szénhidrátszerkezettől függően más-más lektinek használata javasolt. Például, a galektinek az N-acetil-laktózamin tartalmú szénhidrátokra specifikusak, melyek az N- és O-glikánokban egyaránt megtalálhatóak55, a földimogyoró agglutinin az O-glikánokra specifikus56, a konkanavalin A (ConA) az N-glikánok oligomannozil mintázatait ismeri fel57, míg az aleuria-aurantia lektin a fukóz tartalmú oligoszacharidok széles skálájához mutat affinitást58.

A szénhidrátok felé mutatott nagy specifikusságuk miatt a növényi lektineket különböző glikánvegyületek – glikoproteinek, glikopeptidek, glikolipidek vagy szabad glikánok – tisztításánál előszeretettel alkalmazzák45. Nem kizárólag az széleskörűen alkalmazott egyféle lektinnel végzett affinitás kromatográfiát (LAC, single LAC) ismerjük59-60, hanem különböző lektinek kombinációit multi-LAC (MLAC)61 vagy sorozatos LAC1 formájában is kidolgozták, melyek különösen hasznosak hasonló méretű és töltésű, de eltérő szerkezetű glikánok komplex keverékeinek frakcionálására. Az általános eljárások során a megkötött glikánokat a lektin affinitás oszlopról az egyensúly haptén cukrokkal történő megbontásával eluálják. A LAC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerként alkalmazva, nagytisztaságú glikán-vegyületeket eredményez a további szerkezetvizsgálatokhoz50.

1. táblázat: A glikopeptidek és oligoszacharidok affinitás kromatográfiájában leggyakrabban használt lektinek Triviális rövidítés Lektin forrása Monoszacharid specifitás Haptén cukor Megjegyzések a kötésről Konkanavalin A

ConA Canavalia ensiformis α-D-mannóz

α-D-glükóz α-metil-D-mannozid Gyenge kötés biantennás glikopeptidekhez, erős a magas mannóz/hibrid típushoz Borsó lektin Pisum sativum α-D-mannóz α-metil-D-mannozid Bi- és triantennás belső L-fukóz tartalmú glikopeptidek

Lencse lektin Lens culinaris α-D-mannóz α-metil-D-mannozid Bi- és triantennás belső fukóz tartalmú glikopeptidek

RCA-1 Ricinus communis β-D-galaktóz

N-acetil- β-D-galaktózamin Laktóz β(1→4) kötésű terminális galaktozil csoportokat tartalmazó glikopeptidek L4PHA

leukoagglutinin Phaseolous vulgaris β-D-galaktóz

N-acetil-D-galaktózamin Tri- és tetraantennás glikopeptidek E4PHA

erytroagglutinin Phaseolous vulgaris β-D-galaktóz

N-acetil-D-galaktózamin Bi- és triantennás glikopeptidek és oligoszacharidok

SNA Sambucus nigra β-D-galaktóz Laktóz Sziálsav tartalmú glikopeptidek NeuAc-α(26)Gal terminális szekvenciával LTA Lótusz lektin Tetragonobulus pupureas α-D-fukóz Fukóz A glikán külső részén fukózt tartalmazó glikopeptidek

GS-I-B4 Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia 1-34

α-D-galaktóz

N- α-acetil-D-galaktózamin Raffinóz Terminális α-galaktozil csoportot tartalmazó oligoszacharidok

UEA-I Ulex europeaus I α-D-fukóz Fukóz Külső α-L-fukóz csoportot tartalmazó oligoszacharidok

HPA Helix pomatria N- α-acetil-D-galaktózamin N-acetil-D-galaktózamin

Terminális α-GalNAc tartalmú N- és O-kötésű oligoszacharidok nagy affinitással

Jacalin/Jackfruit

lektin Artocarpus integrioflia α-D-galaktóz α-D-metil-galaktozid O-α-galaktozil kapcsolódású terminálist tartalmazó glikopeptidek és oligoszacharidok

PNA Földimogyoró

lektin Arachis hypogaea α-2-N-acetil-galaktózamin

β-Gal(1→3)GalNAC Galaktóz O-β-galaktozil kapcsolódású terminálist tartalmazó glikopeptidek és oligoszacharidok

AAL Aleuria aurantia α-D-fukóz L-fukóz N-acetil-glükózaminhoz α1-6 vagy N-acetil-laktózaminhoz α1-3 kapcsolódású fukóz

MAH, MAA, MAL Maackia amurensis Sziálsav, meghatározott

triszacharidok Laktóz MAH II csak bizonyos sziálsavat vagy meghatározott triszacharid szerkezeteket tartalmazó szénhidrátokat köt

DSA, DSL Datura stramonium N-acetil-glükózamin Kitin hidrolizát Felismeri a β1-4 kötésű N-acetil-glükózamin oligomereket,

Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására 1.2.1 Lektin immobilizálási technikák

A lektinek különböző hordozón történő immobilizálása során olyan felületet alakítanak ki, mely mind a lektin mind a hordozó anyag fizikai-kémiai jellemzőivel rendelkezik. A maximális stabilitás, és a mintafehérjék nem-specifikus kölcsönhatásainak minimalizálása érdekében ideális esetben a hidrofób kötőhelyeket nem tartalmazó, hidrofil jellegű felszínek az optimálisak. Egy másik szempont a lektin és az állófázis felületének összekapcsolását végző, úgy nevezett linker típusa. Jó linkerrel az immobilizált lektinek a természetes állapotukhoz hasonlóan viselkednek, azaz felismerik és megkötik a célmolekulákat, sztérikus gátlás nem lép fel. A különböző mátrixok jellemzéséről több áttekintő tudományos publikáció is készült62-63.

1.2.1.1 Nem-kovalens immobilizálás

A ConA reverzibilis csatolása hidrofób kölcsönhatással polymyxin B (egy dekapeptid) felülethez egy jó példa a nem-kovalens lektin immobilizálásra64. Első lépésben a polymyxin B a primer amin csoportjain keresztül kovalens kötéssel egy felületi plazmon rezonanciás (SPR:

surface plasmon resonance) érzékelő lemezre került rögzítésre. Az így létrejött felületi réteg képes spontán adszorbeálni a ConA molekulákat erős hidrofób kölcsönhatással (KD=1,9×10-10 M). Érdekes módon azt tapasztalták, hogy az így kapott állófázis nagyobb kötőkapacitással rendelkezik, mint a kovalensen immobilizált forma.

A glikozilált lektin indirekt adszorpciója kovalensen kötött lektinekhez egy másik érdekes megközelítés a nem-kovalens immobilizálásra65. Griffonia simplicifolia lektint (GS-I-B4) az aszparaginen keresztül kapcsolódó magasabb rendű mannóz cukorláncaival kötöttek sepharose állófázisra kapcsolt ConA lektinhez, és így oligoszacharidokat választottak el α-kötésű D-galaktóz csoportjaik mennyisége alapján. Az eredmények igazolták, hogy a lektin megőrizte glikán kötő képességét a gyors, kényelmes és kvantitatív immobilizálási módszerrel. Hasonló módszerrel immobilizáltak ConA-t fémes kölcsönhatásokkal réz(II)-iminoecetsav állófázishoz66.

1.2.1.2 Kovalens immobilizálási technikák

Az immobilizált lektinek az affinitás alapú állófázisok kialakítására glikokonjugáltak67, felszabadított glikánok68, glikopeptidek69, poliszacharidok, oldható sejtösszetevők, sőt egész sejtek elválasztására, izolálására egyaránt70 nagy potenciállal rendelkeznek. Ugyanakkor gyakran csak laboratóriumi méretekben sikerült a módszert kidolgozni, aminek az oka

elsősorban az agaróz hordozóban keresendő. Ez a legáltalánosabban használt hordozó a lektinek immobilizálására, azonban mind a kémiai, biológiai és mechanikai stabilitása korlátozott71.

Egyre növekvő tudományos érdeklődés tapasztalható, az újszerű kovalens immobilizálási technikák iránt, melyek stabilabb hordozóra épülnek. A következőkben a különböző kovalens immobilizálási módszereket tekintem át.

A lektin affinitás kromatográfiához, ahogy a publikációk nagy száma is tükrözi, leggyakrabban agarózon immobilizált lektineket használnak1,45,59-61,72-75

. Annak ellenére, hogy az alapötlet – az agaróz mint hordozóanyag használata a lektin immobilizálására – azonos, számos különböző reaktív csoportot és kémiai módszert alkalmaznak a cél elérésére. Ennek eredményeként több megfelelő, megbízható aktivált hordozó és metodológia elérhető napjainkban, melyek nagy része könnyen kivitelezhető.

Az egyik közkedvelt módszer a lektinek immobilizálására a lektinek amin csoportját használja ki. A kötést három módon lehet kialakítani:

• A CNBr hordozó imidokarbonát csoportjának reagáltatása az amin csoporttal haptén cukor jelenlétében, ami a lektin szénhidrát-kötőhelyét megvédi76;

• N-hidroxi-szuccuinimid-észter reagáltatása az amin csoporttal76;

• Schiff-bázis képzés a formil- és amin csoportok közt, amit nátrium-ciano-borohidriddel való redukálás követ, alkil-amidot képezve77.

A legtöbb affinitás kromatográfiában használt lektin agaróz gélhez kötve napjainkban már kereskedelemből beszerezhető, és megfelelő oszlopba töltés után használatra kész.

A szilika tresyl aktiválását már az 1980-as évek elején kidolgozták enzimek és affinitás ligandumok immobilizálására78, és mind a mai napig széles körben alkalmazzák lektinnel bevont szilika affinitás állófázisok kialakítására. Általában a szilikát szilanilálják 3-merkaptopropil-trimetoxiszilánnal szobahőmérsékleten enyhe körülmények között. A tresylált szilikára a lektinek immobilizálását 4 órás óvatos keveréssel foszfát pufferben (pH 8,0) valósítják meg, amit Tris-HCl pufferrel (pH 8,0) a megmaradt szabad tresyl csoportok blokkolása követ, stabil oszlopot eredményezve.

A lektinek felülethez való kapcsolására 1,1’-karbo-diimidazol derivatizált szilikát is alkalmaznak, mely egy ötlépéses protokollal valósítható meg. A glikoproteinek az aktivált szilikához igen jó hatékonysággal kapcsolhatók enyhe körülmények között79.

Az elmúlt években a szilikán való lektin immobilizálási technikákat egyre növekvő a tudományos érdeklődés kísérte. A 3-merkaptopropil-trimetoxiszilánnal derivatizált szilika állófázisokra a fetuin izolálása magzati szarvasmarha szérumból búzacsíra agglutininnel

Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására

(WGA: wheat-germ agglutinin), és a torma peroxidáz (horseradish peroxidase) tisztítása konkanavalin A (ConA: concanavalin A) felhasználásával egyaránt fontos alkalmazások71,80. A magas kihozatali arány és reprodukálhatóság igazolta a szilika alapú állófázisok alkalmazhatóságát LAC elválasztásoknál.

Sikerrel immobilizáltak lektineket kereskedelemben beszerezhető tresyl-tartalmú polimereken – mint a Toyopearl AF-Tresyl 650M vagy a TSK gel tresyl-5PW – is, megfelelően stabil állófázist eredményezve nagyhatékonyságú lektin affinitás kromatográfiához (HPLAC: high performance lectin affinity chromatography)81. Ricinus communis agglutininnel (RCA) sikeresen funkcionalizálták mind a Toyopearl, mind a TSK gel polimer alapú hordozókat. A kapott affinitás kromatográfiás állófázisokat aszialofetuin glikoprotein elválasztásával tesztelték, és az agaróz alapú állófázisokkal összehasonlítva kiváló kihozatalt és adszorpciós kapacitást tapasztaltak. A Toyopearl alapú állófázist alacsony nyomású, nagy specificitású affinitás kromatográfiás glikoprotein analízisre eredményesen használták. A hosszú távú stabilitási vizsgálatok azt mutatták, hogy egyik állófázis kapacitása sem mutatott érzékelhető változást, még 12 hónapos időtartam után sem82. Ugyancsak sikerrel immobilizáltak ConA és WGA lektineket glicidil-metakrilát polimer alapú monolitikus kapilláris oszlopokon nano affinitás folyadék kromatográfiás elválasztásokhoz83.

A cellulózt szintén vizsgálták, mint lehetséges mátrixot ConA és WGA immobilizálására84. A lektineket Schiff-bázis képzéssel kapcsolták a hordozóhoz. A kötést közvetlenül a felülethez, illetve hosszú távtartó molekula (spacer: pentaetilén-hexamin) alkalmazásával egyaránt megvalósították. Utóbbi a kiterjedt (bulky) lektinek, mint a ConA, esetén bizonyult különösen előnyösnek. A WGA spacer molekula nélkül is hatékony affinitás kromatográfiás állófázist eredményezett.

1.2.2 Kromatográfiás alkalmazások

A lektin affinitás kromatográfia (LAC) alapelve, amint a 4. ábra is szemlélteti, hasonló az egyéb affinitás kromatográfiás technikákhoz. Fehérjekeveréket választanak el kromatográfiásan immobilizált lektin mátrixszal, ami a megfelelő cukorszerkezettel rendelkező glikoproteineket felismeri, míg a többi fehérje megkötődés nélkül elhagyja az oszlopot. A mosást alkalmas mosó pufferrel folytatják, amíg az oszlopról fehérje már nem távozik. Ezt megfelelő detektálási módszerrel (általában UV-Vis vagy fluoreszcencia) monitorozzák. Az adszorbeált glikoproteineket az oszlopról jól megválasztott mozgófázissal, mely leggyakrabban a haptén cukor oldata, eluálják.

Az 1990-es években az egyszerű (single) LAC technikát alkalmazták leginkább a glikoproteinek tisztítására. A jól ismert lektint, a ConA-t, használták széles körben a magasabb mannóz szerkezeteket

tartalmazó glikánvegyületek affinitás kromatográfiájához83,85. Az Artocarpus integrifolia

lektint, vagy közismertebb nevén Jacalint elsősorban O-glikánok izolálására alkalmazzák. A Maackia amurensis hemagglutinin (MAH) fő alkalmazási területei a meghatározott triszacharid szerkezeteket tartalmazó vegyületek és sziálsav tartalmú glikoproteinek izolálása86.

1.2.2.1 Sorozatos LAC

A glikánvegyületek elválasztásának hatékonysága növelése érdekében dolgozták ki a sorozatos lektin affinitás kromatográfiát (SLAC: serial LAC). Endo és munkatársai radioaktív N-glikánokat választottak el, melyeket hidrazinolízissel szabadítottak fel és nátrium-ciano-borohidriddel redukáltak. A módszert az 5. ábra szemlélteti1.

Első lépésben a felszabadított oligoszacharidok keverékének három frakcióját választották el ConA oszlopon. Az első frakciót, mely az N -acetil-glükózaminon elágazást nem tartalmazó bi-antennás komplex cukrokból állt, 5 mM koncentrációjú α-metil-glükopiranózzal eluálták (a nyíl az 5. ábra felső kromatogramján). A magasabb mannóz szerkezeteket tartalmazó második frakciót 200 mM koncentrációjú α-metil-mannopiranózzal eluálták (b nyíl az 5. ábra felső kromatogramján). A többi oligoszacharidot a retenciót nem szenvedő frakció tartalmazta (flow through, az első csúcs a kromatogramon).

A második affinitás lépést az első frakció esetében

4. ábra: A lektin affinitás kromatográfia (LAC) sémája

5. ábra: Tríciummal jelölt oligoszacharidok keverékének sorozatos

lektin affinitás kromatográfiája1

Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására

alkalmazták. Ezt a frakciót Aleurta aurantia lektin (AAL) Sepharose oszlopra vitték fel, és fukózzal eluálták (c nyíl a 5. ábra jobb középső kromatogramján) a fukozilált szerkezeteket. A retenciót nem szenvedő frakció a nem-fukozilált oligoszacharidokat tartalmazta.

A ConA oszlophoz nem kötődő oligoszacharidokat Phytohaemagglutinin E 4 (E4-PHA) oszlopon frakcionálták. Sőt az oszlophoz nem kötődő, tri-antennás komplex cukor izomereket Datura stratmonium agglutinin (DSA) oszlopra is felvitték, és 1% N-acetil-glükózamin oligomerekkel eluálták (d nyíl az 5. ábra bal oldali, alsó kromatogramján)1.

A sorozatos LAC koncepcióját komplex glikoproteomikai platformjukhoz, amit szialilált fehérje glikoformok komparatív analízisére dolgoztak ki, Regnier és munkatársai is alkalmazták87. A komplex protokoll tripszin emésztés, sorozatos LAC, belső (internal) standarddal történő kvantifikálás, valamint peptid-N-glikozidáz F (PNGase F) emészéssel deglikozilált peptidek fordított fázisú kromatográfiás (RP-HPLC) frakcionálásának és tandem tömegspektrometriás (MS/MS) peptidszekvenálásnak a kombinációja. A sorozatos LAC-hoz a szerzők Sambucus nigra agglutinin (SNA) és ConA oszlopokat használtak.

Novotny és munkatársai szilika alapú sorozatos LAC technikát alkalmaztak mikrooszlopok formájában vérszérum glikoproteinek szelektív dúsítására5. A biológiai folyadékok nagy térfogata a vizsgálatokhoz így lényegesen csökkenthető, a lehetséges mintaveszteségek minimalizálhatók. A különböző glikoproteinek szelektív dúsításához négy különböző lektint tartalmazó szilika állófázist használtak, ezek a ConA, SNA-I, UEA-I és PHA-L voltak.

Mikrokromatográfiás sorozatos LAC glikoprotein dúsítási technikájuk nagy előnye a közvetlen kompatibilitása kapilláris folyadékkromatográfiával és tandem tömegspektrometriával (µLC-MS/MS).

1.2.2.2 Multi-LAC

Az átfogó vizsgálatok, azt mutatják, hogy az N- és O-glikánok reprezentálják a teljes humán szérum fehérje összetételét. A reprezentatív különbségek vizsgálatára Hancock és kollégái kidolgozták az úgy nevezett multi-lektin affinitás kromatográfiát (MLAC) agarózon immobilizált ConA, WGA és Jacalin lektinek felhasználásával. A szérum minták glikozilációs mintázatainak változásait a fehérjék szabályozott elúciójával monitorozták, specifikus haptének alkalmazásával. Az eluált fehérjék triptikus emésztményeit LC-MS/MS analízisnek vetették alá. Módszerük reprodukálhatónak és glikoprotein-specifikusnak bizonyult, ami a proteomikai vizsgálatok széles dinamikus tartományát lefedi61.

A szerzők neuramindáz és fukozidáz enzimekkel kezelt humán szérum minták változásainak vizsgálatára is alkalmaztak MLAC oszlopot. Elképzelésük a kezeletlen és

módosított humán szérum glikoproteinek összehasonlításán alapult. Az MLAC oszloppal való izolálás lehetővé tette az enzimekkel kezelt glikoproteinek eloszlásának eltolódásának vizsgálatát. Érzékeny módszert eredményezett a humán szérum glikoproteinek sziálsav és fukóz tartalmának változásainak értékelésére72.

1.2.2.3 Monolitikus lektin affinitás oszlopok

A közelmúltban El Rassi és kollégái lektinekkel borított felszínű monolitikus kapilláris kromatográfiás oszlopokat ismertettek83. ConA-t és WGA-t immobilizáltak két különböző polimeren. Poli-glicidil-metakrilát és etilén-dimetakrilát kopolimert, valamint poli-glicidil-metakrilát, etilén-dimetakrilát és 2-metakriloxi-etil-trimetil-ammónium klorid kopolimerét használták hordozóként, hogy semleges és kationos makropórusos polimer mátrixokat kapjanak. Mindkét immobilizált lektinekkel funkcionalizált monolit erős affinitást mutatott a megfelelő cukor szekvenciát tartalmazó glikoproteinek és oligoszaccharid láncok felé. A semleges, lektinnel borított metakrilát oszlopok ellenállása nyomással vezérelt áramlással szemben nagyobbnak adódott. Az erős affinitás kötés (KD = 10-3 – 10-5) következtében híg minták (~10-8 M) viszonylag nagy térfogatainak injektálására is lehetőség nyílt, így dúsítva majd izolálva a glikánvegyületeket. Ezeket a monolit oszlopokat kétdimenziós elválasztási technika első dimenziójaként alkalmazták, fordított fázisú nanoLC-vel kombinálva.

1.2.2.4 Lektin affinitás alapú glikán profilozás

Hirabayashi és munkatársai kidolgoztak egy lektin affinitáson alapuló glikán profilozási stratégiát, amit Glyco-catch módszernek neveztek el88-89. A módszerük az következő ötlépéses eljáráson alapul:

• LAC: különböző lektin oszlopok használatával, egyszerű vagy sorozatos technikával, a különböző szénhidrátokat tartalmazó glikoproteinek izolálására.

• Proteáz emésztés: az izolált glikoproteinek glikopeptideket eredményező Achromaobacter proteáz enzimes emésztése (lizin specifikus enzim kielégítő hasítási hatékonysággal).

• Második LAC: a cél-glikopeptidek megkötése az első lépésben használt lektin oszloppal.

• Az izolált glikopeptidek HPLC tisztítása

• Szekvencia elemzés: disszociációs állandó meghatározás90 és frontális affinitás kromatográfia91.

Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására 1.2.2.5 Elektroforetikus alkalmazások

A lektin borítású állófázisok kromatográfiás alkalmazásai mellett affinitás elektroforetikus elválasztások is ismertek. Különböző szénhidrát-szerkezetű α-fetoprotein glikoformok elemzésére alkalmaztak lektin affinitás elektroforézist (LAE)92. A szérum α-fetoproteint különböző karcinómás betegek mintáiból nyerték. A mintákat kétdimenziós LAE, illetve LAC-val csatolt LAE technikákkal vizsgálták. Az α-fetoprotein több mint 10 glikoformját sikerült azonosítani és jellemezni a módszerrel. Ugyanez a kutatócsoport mélyrehatóan vizsgálta a LAE technikát, és bemutatták a lektin-gradiens gél affinitás elektroforézist 93 immuno-enzimatikus detektálással kemilumineszcenciás amplifikációval94.

Az α-fetoprotein erythroagglutinating phytohemagglutinin (E4PHA) elválasztásánál a lektin nem csak a specifikus csoportokat ismerte fel, mint az α-L-fukóz vagy β-D-galaktóz, de a teljes oligoszacharid szerkezeteket is, a harmadlagos szerkezet alapján eltérő affinitásokat eredményezve. Az α-fetoprotein egyetlen cukorláncot tartalmaz95, ami a glikoprotein analízisét leegyszerűsíti, mivel viszonylag egyértelműen feleltethetőek meg egymásnak az egyes glikoformok sávjai és a fehérje ismert szénhidrát szerkezetei.

1.2.3 Boronsav és más pszeudo-lektinek

Mivel a cisz-vicinális hidroxil csoportokat tartalmazó szerkezetekkel kötést létesítenek, a boronsavak pszeudo-lektinnek tekinthetők. Korai munkájukban Hageman és munkatársai vizsgálták a boronsav mátrixok tulajdonságait és alkalmazhatóságát glikoproteinek affinitás kromatográfiájában96. Liang és kollégái boronsavat használtak glikozilált és nem glikozilált borjú alfa-krisztallin elválasztására Glyco Gel B affinitás kromatográfiával97. Arra következtettek, hogy a glikoziláció következtében a borjú alfa-krisztallin harmadlagos szerkezete megbomlik, részlegesen letekeredik, és így elősegíti a szulfhidril oxidációt.

Li és munkatársai neoglikoproteineket választottak el nem glikozilált vegyületektől98. A szerzők Tris-HCl puffert használtak árnyékolásként (shielding) a kromatográfiás lépés alatt, ami hatékonynak bizonyult a glikoprotein-boronát kölcsönhatások kiküszöbölésére, míg a szénhidrát-boronát kölcsönhatást csak kissé befolyásolta.

Egy másik munka új típusú boronsavval funkcionalizált töltetet ismertet nagyhatékonyságú affinitás kromatográfiához99. A hidrofil, ellenálló, porózus polimer részecskékkel glikált fehérjék, mint a glikált albumin diabéteszes szérum mintákban, mennyiségi analízisét végezték.

A lektinek helyettesítésére a fenil-boronsav tartalmú vízoldható polimerek és kismolekulák, mint affinitás ligandumok a magasabb mannóz szerkezetek megkötésére, érdekes szintetikus megközelítést jelentenek. Palanisamy és kollégái a glikoproteinek mannóz

A lektinek helyettesítésére a fenil-boronsav tartalmú vízoldható polimerek és kismolekulák, mint affinitás ligandumok a magasabb mannóz szerkezetek megkötésére, érdekes szintetikus megközelítést jelentenek. Palanisamy és kollégái a glikoproteinek mannóz