Izoelektromos fókuszálás

Izoelektromos fókuszálássorán olyan körülményeket teremtünk, hogy afehérjékkizárólag azizoelektromos pontjukalapján váljanak elegymástól (lásd6.19. ábra). Az eljárás azon alapul, hogy a fehérjéken lévő, proton leadásra illetve felvételre képes csoportok disszociációs állapota függ a környezetük pH értékétől (lásd Henderson-Hasselbalch egyenlet). A fehérjék nettó töltése tehát függ a közeg pH értékétől. Amennyiben egy fehérjén a savas oldalláncok (Asp, Glu) száma meghaladja a bázikus (Arg, Lys, His) oldalláncok számát, úgy a fehérje semleges közegben negatív töltésű lesz, izoelektromos pontja (IEP), vagyis az a pH érték, amelyen a fehérje eredő töltése nulla, a savas tartományba esik. Az ilyen fehérjéketsavas fehérjéknek is nevezzük. Amikor a fehérje bázikus oldalláncainak a száma múlja felül a savas oldalláncok számát, akkor semleges közegben a fehérje pozitív töltésű lesz, izoelektromos pontja a bázikus pH tartományba esik. Ezeket a fehérjéketbázikus fehérjéknek is szokták nevezni.

6.19. ábra: A fehérjék izoelektromos fókuszálása

Mivel az eltérő fehérjék IEP értéke igen széles tartományt fed le (lásd6.3. táblázat), ezért az izoelektromos pont alapján történő elválasztás hatékony módszer.

Ha a közeg pH értéke alacsonyabb, mint a fehérje IEP értéke, akkor a fehérje pozitív töltésű lesz, és a katód felé vándorol. Ha a közeg pH értéke magasabb, mint a fehérje IEP értéke, akkor a fehérje töltése természetesen negatív lesz, és a fehérje az anód felé vándorol. Ha a pH értéke éppen megegyezik a fehérje IEP értékével, akkor a fehérje nettó töltése nulla, ezért elektroforézis során nem vándorol.

Amennyiben olyan közegbe helyezzük a fehérjét, amelyben a pH a katód és az anód között fokozatosan (gradiens mentén) változik, úgy a fehérje elindul a vele ellentétes töltésű pólus felé. A pozitív töltésű anódnál alacsony pH értékű közeget, a negatív töltésű katódnál magas pH értékű közeget hoznak létre.

6.3. táblázat: A fehérjék izoelektromos pontja nagyon széles tartományt fed le

Miközben a fehérje a változó pH értékű közegben vándorol, a töltése is változni fog. Ha negatív töltésűként az anód felé vándorol, úgy az egyre savasabb közegben egyre több protont vesz fel egészen addig, míg a rajta lévő negatív és pozitív töltések száma megegyezik, vagyis eléri az izoelektromos pontját. Ekkor a fehérjére nem hat eredő elektromos erő, ezért nem vándorol tovább. Ha a spontán diffúzió miatt mégis közelebb kerül az anódhoz, akkor újabb protonok felvétele miatt pozitív töltésűvé válik, és visszafelé vándorol a katód felé. Ugyanilyen gondolat mentén, ha az adott fehérje pozitív töltésűként a katód felé vándorolt, akkor az egyre magasabb pH értékű tartományon át haladva fokozatosan protonokat ad le, míg eléri izoelektromos pontját, és megáll. Ha diffúzióval közelebb kerül a katódhoz, akkor protonokat ad le, és az elektromos erő újra az anód felé vándoroltatja. Tehát a fehérjék mindegyike a saját IEP értékének megfelelő pH értékű gél-tartományba fókuszálódik, a fehérjék IEP értékük alapján válnak el egymástól (lásd6.20. ábra). A fenti folyamatok logikájából következik, hogy érdektelen, hogy a fehérjét a gél mely pontján visszük a rendszerbe, ettől függetlenül „megtalálja” az IEP értékének megfelelő pontot.

6.20. ábra: Az izoelektromos fókuszálás fizikokémiai alapelve

Az eljárás meghatározó eleme, hogy egy - lehetőleg lineáris - gradiens szerint változó pH értéket hozzunk létre a gélben. Erre két módszer ismeretes. Az egyik az amfolit hordozók alkalmazása. Az amfolit kifejezés az amfoter elektrolit kifejezés rövidítése. Az amfolitok olyan kis szerves molekulák, amelyeken egyszerre vannak jelen gyenge savas és gyenge bázikus csoportok. Ezeknek az anyagoknak az eredő töltése is a pH függvénye.

Az izoelektromos fókuszálás során olyan amfolitokból készítenek keveréket, amelyek IEP értéke egymástól csak kismértékben tér el, és együttesen átfednek egy bizonyos IEP tartományt. Ezt a keveréket a gélbe juttatják, és létrehozzák a gélben az elektromos teret. Ekkor a fehérjékre már említett folyamat zajlik le. Minden amfolit elindul a töltésének megfelelően valamelyik pólus felé, majd az izoelektromos pontjánál megáll. Mihelyst ez a folyamat lezajlott, az amfolitok pufferként működve stabilan tartják a közvetlen környezetük pH értékét. Így alakul ki a pH gradiens, amiben a fehérjék elválaszthatók.

A másik, a fentinél még finomabban szabályozott pH gradienst úgy hozzák létre, hogy speciális amfolitokat alkalmaznak. Olyanokat, amelyeket kovalens kötésekkel bele lehet polimerizálni az akrilamid gélbe. A gélöntés során hozzák létre a leendő gél oldatában a megfelelő amfolitok gradiensét, amely a gél polimerizáció során kovalensen rögzül. Így ezekben a gélekben egyfajta immobilizált pH gradiens alakul ki. Az, hogy milyen értékek között érdemes a pH gradienst létrehozni, függ az elválasztandó fehérjék IEP értékeitől.

Bármelyik eljárással hozzuk is létre a pH gradienst, amikor már minden fehérje elérte az IEP értékének megfelelő helyzetet a gélben, az elektroforézist folytatva nem történik további vándorlás. A rendszer egyfajta állandósult állapotba kerül.

Az izoelektromos fókuszálás során jelentkező egyik potenciális technikai problémát az jelenti, hogy a fehérjék oldhatósága izoelektromos pontjukon a legalacsonyabb, így egyes fehérjék az IEP értékük közelében kicsapódhatnak a gélben. Ezt megakadályozandó leggyakrabban ureát is adnak a rendszerbe, amely segít oldatban tartani a fehérjéket.

Ez egyes fehérjék esetében ahhoz vezet, hogy a fehérje oldatban marad, de denaturált állapotban lesz. Urea alkalmazásakor a kiértékelésnél figyelembe kell venni, hogy a natív illetve a denaturált állapotú fehérje izoelektromos pontja eltérő lehet (mivel az egyes disszociábilis csoportok pK_aértéke függ a csoport lokális környezetétől). Az urea emellett a nem diszulfidhidakkal stabilizált alegységszerkezetet is felbonthatja. Membránfehérjék elválasztásánál pedig a fehérje oldatba vitelét nem-ionos detergensekkel segítik elő.

Izoelektromos fókuszálásnál kizárólag IEP alapján igyekszünk elválasztani a fehérjéket, ezért a gél kizárólag a keveredéses folyadékáramlás megakadályozását szolgálja, tehát nem szabad molekulaszűrőként viselkednie. Ennek érdekében kifejezetten alacsony akrilamid koncentrációjú, nagy pórusméretű géleket alkalmaznak. Emiatt ritkábban ugyan, de ennél a technikánál agaróz gélt is alkalmaznak. Az eljárást leggyakrabban vízszintesen elhelyezett gélekben folytatják intenzív hűtés mellett.