negyedleges szerkezete
5.1. A fehérjék térszerkezet-vizsgálata
5.1.1. A biológiai objektumok vizualizálásának jelentősége
Amikor a körülöttünk lévő világ megismeréséhez információkat gyűjtünk, számos érzékszervünkre támaszkodunk.
A legtöbb ismeretet kétségtelenül mégis a látásunk biztosítja. A vizuális információ rendkívül sok, az emberi elme számára könnyen feldolgozható adatot hordoz. Számos ismert mondás, mint pl. hogy „hiszem, ha látom”, vagy
„egyetlen kép többet ér ezer szónál” is erre utal.
Amikor egy összetett objektumot meglátunk, a vizuális információ segítségével azonnal adatokat kapunk arról, hogy az objektum egyes egységei miként kapcsolódnak egymáshoz, az adott objektum hogyan „viselkedhet”, hogyan működhet. Amikor egy objektumot szemlélünk, akkor - anélkül, hogy ezt tudnánk - pontokra bontva képezzük le azt, feldolgozva az egyes részek térbeli viszonyát, egymáshoz kapcsolódásuk mikéntjét. Mindez azért lehetséges, mert a fény az objektum pontjain szóródik, és az egy pontból szétszóródó fénysugarakat a szemünk optikai rendszere újra egy pontba gyűjti össze. Ennek a leképezésnek a felbontási képessége azzal az adattal jellemezhető, amely megmutatja, hogy legfeljebb milyen közel lehet egymáshoz két tárgypont ahhoz, hogy valóban két külön pontként tudjuk leképezni. A maximálisan elérhető felbontás nagyjából egyenlő a szórt, és újra összegyűjtöttfény hullámhosszának a felével. Az emberi szem fényérzékelő molekulái a 400-800 nanométeres (egy nanométer a méter egy milliárdod része; 1 nm = 10-9m) hullámhossztartományba eső fénysugarakat képesek érzékelni. Ezért a látható fényen alapuló felbontás – hiába nagyítjuk a képet különböző mikroszkópokkal –, nem haladja meg a 200-400 nanométert, vagyis a néhány tized mikrométert.
Fénymikroszkóppal tehát már láthatók a mikrométeres mérettartományba eső baktériumok, vagy az eukarióta sejtek sejtmagja és bizonyos körülmények között a sejtmagban lévő kromoszómák is, de a sejtek ennél részletesebb belső felépítése már nem észlelhető. Azt az elektromágneses sugárzást, amelynek hullámhossza az atomok és a kémiai kötések mérettartományába esik Wilhelm Conrad Röntgen fedezte fel 1895-ben, amiért 1901-ben megkapta az első fizikai Nobel-díjat. Felfedezése nyomán igen hamar elindultak a röntgensugáron alapuló szerkezetvizsgálatok.
5.1.2. Szerkezet-meghatározás röntgendiffrakcióval
A néhány Angström hullámhosszúságú, tehát az atomok és kémiai kötések mérettartományába esőröntgensugárzás intenzíven elhajlik és szóródik az atomok elektronfelhőjén. Ezeket a nagyenergiájú szóródó sugarakat nem lehet optikai eszközökkel újra egy pontba fókuszálni. Azelhajlási (diffrakciós) mintázatugyan tartalmazza a szóródást kiváltó objektumra vonatkozó leképezendő információt, de az a klasszikus, gyűjtőlencséken alapuló képalkotói eljárásokkal nem rekonstruálható.
Kezdetben röntgensugár forrásként vákuumcsöveket használtak, amelyekben nagyfeszültség segítségével egy katódból az anódba „csapódó” elektronok energiájának egy része az elektronsugárra merőleges irányú röntgensugarat eredményez. Ma is ilyen elven működnek a kisebb kutatóintézetek „házi” röntgenforrásai. A röntgendiffrakciós
szerkezetkutatásokat ugyanakkor az utóbbi évtizedekben nagyban fellendítette a részecskegyorsítók elterjedése, amelyek kiváló röntgensugárforrások (szinkrotron sugárzás).
Ha az atomok, illetve az atomokból álló molekulák szabályos rendben egymáshoz rendeződve kristályt alkotnak, az egymástól periódusosan, szabályos távolságokra lévő pontokról szóródó sugarak a tér meghatározott pontjain egymást erősítve interferálnak. Az interferencia-mintázat röntgenfilmen, vagy egyéb megfelelő detektoron észlelhető (lásd5.1. ábra).
5.1. ábra: A röntgenkrisztallográfiás eljárásokban a kristályba rendeződött molekulák elektronjain szóródó röntgensugarak diffrakciós mintázata alapján fejtik meg a molekula térszerkezetét
Ezt a jelenséget elsőként Max von Laue fedezte fel, és elsőként ő dolgozta ki, hogy a diffrakciós kép miként függ össze a kristály geometriai adataival. Eredményeiért 1914-ben Nobel díjat kapott. Vele nagyjából egy időben William Lawrence Bragg is kristályos anyagok és röntgensugárázás kölcsönhatását kezdte vizsgálni. Az ehhez szükséges kísérleti berendezést édesapja, William Henry Bragg építette meg. A szerkezetvizsgálatban elért eredményeikért 1915-ben megosztott fizikai Nobel-díjat kaptak. A röntgensugarakat tehát már igen korán elkezdték kristályos anyagok belső szerkezetének feltárására használni.
Ahogyan az előző fejezetben láttuk, a fehérjék vonatkozásában az első használható adatokat mégsem kristályos, hanem rostokba szerveződő kvázi-kristályos anyagokról készítették. James Watson és Francis Crick 1953-ban az angliai Cambridge-ben dolgozta ki a DNS-szerkezet kettős spirál modelljét. Munkájuk során nagyban támaszkodtak azokra a röntgendiffrakciós eredményekre, amelyeket a londoni King’s College-ben dolgozó Maurice Wilkins és Rosalind Franklin értek el DNS-rostok vizsgálatával. Az eredményekért Watson, Crick és Wilkins 1962-ben orvosi Nobel-díjat kaptak.
Ugyanebben az évben kapott kémiai Nobel-díjat a szintén Cambridge-ben tevékenykedő John Kendrew és Max Perutz, akik az ötvenes évek végénröntgenkrisztallográfiai vizsgálatokkal megfejtették az oxigént tároló mioglobin, illetve az oxigént szállító hemoglobin térszerkezetét (a mioglobin kristály röntgendiffrakciós képét az5.2. ábra mutatja). Ezekben a vizsgálatokban nem rostokat, hanem valódi fehérjekristályokat használtak.
5.2. ábra: A mioglobin fehérje kristályának röntgendiffrakciós képe
A röntgenkrisztallográfia a mai napig a leghatékonyabb fehérjeszerkezet meghatározó módszer. A makromolekuláris térszerkezetek adattárában (PDB:Protein Data Bank) a könyv írásának idején több mint 76000 olyan fehérjeszerkezet található, amelyet röntgendiffrakcióval határoztak meg. A módszer nagy előnye, hogy szinte méretkorlát nélkül képes akármekkora fehérje, vagy egyéb makromolekuláris komplexek térszerkezetét feltárni. Jó példa erre a riboszóma, mint szupramolekuláris komplex atomi felbontású térszerkezetének meghatározása, ami 2009-ben kémiai Nobel-díjat eredményezett Venkatraman Ramakrishnan, Thomas Steitz és Ada Yonath számára.
Ugyanakkor, ahogy minden technikának, a röntgenkrisztallográfiának is vannak korlátai. Az egyik probléma az, hogy a makromolekulát kristályosítani kell, ami az esetek nagy részében nem egyszerű feladat. A másik felmerülő probléma, hogy vajon a kristályban tapasztalt szerkezet mennyiben felel meg az oldatban lévő, natív molekula szerkezetének.
Amakromolekuláris kristályok nagy (~40-60%) százalékban tartalmaznak vizet, ami amellett szól, hogy az oldatszerkezet és a kristályszerkezet megegyezhet. Ugyanakkor a kristály úgy jön létre, hogy a rácspontokon lévő molekulák között másodlagos kölcsönhatások alakulnak ki. Ezek a kölcsönhatások módosíthatják a molekulák konformációját. Ha egy nem tökéletesen natív konformáció kedvez a kristály létrejöttének, akkor ez a konformáció jelenik meg a kristályban.
Bár a röntgenkrisztallográfia egy rendkívül megbízható, és nagyon sikeres vizsgálati mód, nagyon hasznos, hogy létezik egy attól teljesen független fizikai elveken alapuló, oldatszerkezetek meghatározására alkalmas eljárás, a mágneses magrezonancia (NMR) spektroszkópia.
5.1.3. Szerkezetmeghatározás mágnesen magrezonanciával
A térszerkezet meghatározás során kiderítjük, hogy egy molekulában az atomok egymáshoz képest hogyan rendeződnek el a térben. Ezt az információt úgy is meg lehetne fejteni, ha nem az atomok egy adott koordinátarendszerben vett pozícióját határoznánk meg, hanem az egyes atomok egymástól való távolságát. A kiértékelés a térképészeti háromszögelési eljárás egyfajta háromdimenziós analógiája szerint történik. Annyi távolságadatot kell meghatározni, hogy csak egyetlen olyan modell létezzen, amely ellentmondásmentesen megfelel az összes meghatározott távolságnak.
A fenti eljáráshoz egy olyan fizikai jelenség szükséges, amellyel meg lehet határozni oldatban lévő makromolekulák egyes atomjainak egymástól való távolságát. Ez a fizikai jelenség a mágneses magrezonancia (NMR:nuclear magnetic resonance), az eljárás azNMR spektroszkópia(lásd5.3. ábra).
5.3. ábra: A mágneses magrezonancia (NMR) jelensége.Külső mágneses térbe helyezett, eredő spinnel rendelkező atommagok kétféle spin állapotának energiája eltérő. Az eltérés mértéke egyenesen arányos a mágneses térerővel.
Az NMR spektroszkópiában alkalmazott mágneses térerők esetén a két állapothoz tartozó energiakülönbség mértéke az elektromágneses sugárzás rádióhullám-tartományába esik. Megfelelő frekvenciájú rádióhullámmal a spin a
magasabb energiaszintű állapotra gerjeszthető. Adott mágneses térerő esetén a gerjesztéshez szükséges rádióhullám frekvenciája jellemző az adott atommagra, és annak kémiai környezetére.
A mágneses magrezonancia egy fizikai jelenség: külső mágneses térbe helyezett (megfelelő) atommagok képesek elektromágneses sugárzást elnyelni, majd újra kibocsájtani. Az elnyelt elektromágneses sugárzás frekvenciája függ a külső mágneses tér erősségétől, és az atommag mágneses tulajdonságától. Ez utóbbi attól függ, hogy az atommag mely elem mely izotópjához tartozik.
A neutronok és a protonok ½ értékű saját forgásmomentummal, más néven spinnel rendelkeznek. Azoknak az izotópoknak az atommagjai, amelyek páros számú protonból és páros számú neutronból állnak, a Pauli féle kizárási elv miatt nem rendelkeznek eredő spinnel, mert nem lehet egyetlen protonjuknak illetve neutronjuknak sem tökéletesen azonos a kvantumállapota. A páros számú protonok illetve a páros számú neutronok spinjei ezért páronként ellentétes értékűek, kioltják egymást. Ezzel szemben minden olyan izotópatommagja rendelkeziknem nulla értékű spinnel, és ezzel arányos mértékű saját mágneses momentummal, amelyben a protonok és / vagy a neutronok száma páratlan. Ilyen izotópok pl. a1H,13C,15N,31P.
A kétféle spin energiájának különbsége arányos a külső mágneses térerővel. Adott erősségű külső mágneses tér alkalmazása mellett megfelelő frekvenciájú (általában a rádióhullám frekvenciatartományába eső) elektromágneses sugárzás elnyelése útján a spin az alacsonyabb energiájúból a magasabb állapotba gerjeszthető. Az alapállapotba való visszatéréskor az elektromágneses sugárzás kibocsájtódik.
A spin energia-átmenetéhez szükséges rádióhullám frekvenciája függ az adott atommag kémiai környezetétől, az azt körülvevő elektronok árnyékoló hatása miatt. A modellvegyülethez képesti frekvenciaeltolódást, más néven kémiai eltolódást a frekvencia milliomodrész mértékében (ppm:parts per million) fejezik ki. A kémiai eltolódás miatt egy összetettebb molekulában az egyes atommagok eltérő környezetük miatt egyedileg azonosíthatók.
Az egyik spin szelektív gerjesztése az úgynevezett nukleáris Overhauser-effektus (NOE) következtében megváltoztathatja a térben közel lévő más spinek gerjeszthetőségét. Ezen alapul a térbeni kapcsolatok feltérképezése.
Összefoglalva, az NMR mérésekkel egy bizonyos méret (40 kDa) alatti makromolekulák oldatban mutatott térszerkezete meghatározható a makromolekulában lévő atommagok azonosítása és egymáshoz képesti távolságuk mérése révén (lásd5.4. ábra).
5.4. ábra: A fehérje térszerkezete megfelelő mennyiségű, atommagok közötti távolságadat, mint kényszerfeltétel-rendszer alapján NMR spektroszkópiai adatokból meghatározható.
Megfelelő NMR vizsgálatok a szerkezet meghatározáson felül a szerkezetre vonatkozódinamikai adatokkal is szolgálhatnak. Megmutathatják, hogy a molekula egyes csoportjai milyen ütemben változtatják a pozíciójukat.
A PDB adatbankban jelenleg mintegy 8800 olyan fehérjeszerkezet van, amelyet NMR-rel oldottak meg. A jelenlegi statisztikák szerint tehát az ismert szerkezetek mintegy 90%-át röntgendiffrakcióval, 10 %-át NMR spektroszkópiával határozták meg. A két technika jól kiegészíti egymást. A röntgendiffrakciónál nincs méretkorlát, és általában kevés fehérje kell hozzá, de a kristályosítás nem minden fehérje esetén sikeres. A kristályosítás sikertelenségének egyik oka lehet az, hogy a fehérje túl kicsi (nem alakul ki elég kölcsönhatás a molekulák között), és/vagy túl mozgékony a szerkezete. Éppen az ilyen fehérjék ideálisak NMR vizsgálatokra, amelyekből kiderülhet a fehérje oldatban mutatott szerkezetén kívül a szerkezet dinamikai viselkedése is.
Ezek után rátérünk a globuláris fehérjék harmadlagos szerkezetének bemutatására.