Az Anfinsen-kísérlet

ChristianAnfinsenaz 1960-as évek elején bizonyította, hogy egy kisméretű, globuláris enzim fehérje, azRN-áz (ribonukleáz, RNS-bontó enzim; a térszerkezetét, kiemelve a 4 diszulfidhidat, lásd 5.24. ábra) tökéletesen reverzibilisen renaturálható(lásd5.25. ábra).

A kísérlet lényege röviden a következő: az RN-áz enzimaktivitása jelzi a natív szerkezet meglétét, ezért ezen keresztül mérhető, hogy a jelenlévő RN-áz molekulák hanyadrésze van natív állapotban. Az RN-áz fehérje diszulfidhidakat is tartalmaz, azért teljes denaturáláshoz nem elegendő denaturálószert, ureát adni, a diszulfidhidakat valamilyenredukálószerrel, például merkaptoetanollal fel kell nyitni. Urea és merkaptoetanol hozzáadására az RN-áz fehérje „letekeredett”, az aktivitása teljesen megszűnt.

5.24. ábra: Az RN-áz enzim térszerkezete.(világoskék: β-lemez, barna: α-hélix, sárga: diszulfidhíd; PDB: 2AAS) A kísérlet lényegi része ezután következett. Amint az ureát és a merkaptoetanoltdialízissel eltávolította, a fehérje minden különleges segédanyag nélkül visszanyerte az aktivitását, feltekeredett (lásd5.25. ábra). Az is kiderült, hogy amennyiben a merkaptoetanolt gyorsan, és teljes mértékben eltávolította, a feltekeredés alacsony hatékonyságú volt. Ha azonban nagyon alacsony koncentrációban hagyott az oldatban merkaptoetanolt (a teljes redukáláshoz szükségesnél sokkal alacsonyabb koncentrációban), akkor a feltekeredés hatékonysága rendkívüli mértékben megnőtt.

5.25. ábra: Az Anfinsen-kísérletben szereplő fehérjeszerkezeti állapotok, és az ezekhez vezető körülmények.

A hibás diszulfidhidas állapot akkor halmozódik fel, ha a redukálószert gyorsan eltávolítják.

A natív RN-áz molekulában 4 diszulfidhíd, a teljesen letekeredettben tehát 8 szabad cisztein van. A redukálószer gyors és teljes eltávolítása azzal járt, hogy felszaporodtak azok a szerkezetek, amelyek hibás diszulfidhidakat tartalmaztak. Ezekből a lokális (tehát nem abszolút) szabadentalpia minimumokat reprezentáló hibás szerkezetekből csak a diszulfidhidak felbomlásával lehet kikerülni, ami lassú folyamat. Kis koncentrációban lévő merkaptoetanol elegendő volt ahhoz, hogy felbontsa a hibás, feszített szerkezetű diszulfidokat, új esélyt adva a molekuláknak a helyes feltekeredésre. A natív állapotra jellemző, stabilabb diszulfidhidakat a nagyon alacsony koncentrációban alkalmazott merkaptoetanol nem bontotta fel. Később számos más fehérje esetében is sikerült kimutatni, hogya térszerkezetet az elsődleges szerkezet kódolja.

Az Anfinsen-kísérlet elvi jelentősége: a kísérlet bebizonyította, hogy a fehérjefoldingja a denaturációt kiváltó okok megszűntévelspontán végbemegy. Ez csak azzal magyarázható, hogy a natív térszerkezet valamilyen módon

„bele van kódolva” a fehérje aminosavsorrendjébe. Az aminosavsorrend, tehát az elsődleges szerkezet egyértelműen meghatározza a térszerkezetet, tehát a harmadlagos szerkezetet! Anfinsen ezért a felismerésért 1972-ben kémiai Nobel-díjat kapott.

Az önálló feltekeredés képessége egyfajta autonómiát jelent a fehérjékre nézve. A biológiai rendszerekben számos esetben tapasztalunk alapvető egymásrautaltságot a komponensek között. Például DNS kódolja a fehérjéket, de a dekódolást, illetve a DNS másolását fehérjék végzik. A feltekeredés képessége ugyanakkor éppenséggel lehet a fehérje autonóm tulajdonsága.

Fontos kihangsúlyozni, hogy a tudomány mai állása szerint pusztán az aminosavsorrendből, egyéb független információk (például hasonló szekvenciájú fehérjék térszerkezetének ismerete) nélkül a kutatók egyelőre nem tudják kiszámolni, „meghatározni” a fehérje térszerkezetét. Az információ tehát „ott van”, de annak kifejtési módját egyelőre nem sikerült kellő részletességgel feltárni.

Az Anfinsen kísérlet azt mutatja meg, hogy nincsen elvi akadálya annak, hogy egy fehérje a szekvenciájában kódolja a térszerkezetét, és autonóm módon képes legyen feltekeredni. Ez azonban nem jelenti azt, hogy az élő szervezetben ne lenne a legtöbb fehérje számára hasznos a feltekeredés folyamatának segítése, katalizálása. Ismert tény, hogy a sejtekben számos olyan fehérje működik, amely javítja a feltekeredés hatékonyságát. Ezek a dajkafehérjék(chaperon-ok).

A sejtben hatalmas koncentrációban vannak jelen a fehérjék. Amikor a polipeptidlánc szintetizálódik, a még el nem készült lánc az oldat felé forduló apoláros részei miatt aggregálódhat. A dajkafehérjék egyik típusa (chaperonin-ok) hatalmas fehérje komplexet alkot, amely egyfajta kalitkába zárja a letekeredett fehérjét (Anfinsen tiszteletére ezt Anfinsen-kalitkának nevezték el), és ATP bontásból származó energiával segíti a feltekeredést. A segítés főleg az aggregálódás megakadályozásán keresztül történik.

A kólibaktériumGroEL/GroESchaperonin komplexének szerkezetét az5.26. ábraillusztrálja. A GroEL és a GroES fehérjék több alegységből állnak, tehát negyedleges szerkezettel bírnak (lásd5.6. fejezet).

A GroEL összesen 14 darab, 57 kDa méretű alegységből alakul ki. Szerkezete két gyűrűből épül fel, mindkét gyűrűt 7 alegység alkotja. A 14-alegységes fehérje így D₇-es szimmetriával rendelkezik. (A szimmetriák általános leírását lásd5.6). A két gyűrű egy hengert alkot. A GroES 7 darab, 10 kDa méretű alegységből áll, és sapkaszerűen lezárja a henger egyik oldalát. Így jön létre az Anfinsen-kalitka.

Más dajkafehérjék konformációs csapdákból segítik kijutni a feltekeredő fehérjét. Az eukarióták endoplazmás retikulumában működőprotein-diszulfid-izomerázpéldául az Anfinsen-kísérletben kis koncentrációban alkalmazott merkaptoetanollal analóg módon segíti a feltekeredést: elősegíti a hibás diszulfidhidak bomlását. (A első protein-diszulfid-izomeráz enzimet magyar kutató, Venetianer Pál írta le.) Szintén konformációs csapdából segíti kijutni a feltekeredő fehérjét apeptidil-prolin cisz/transz izomerázenzim is, amely a nem natív konfigurációjú prolinok átalakulását katalizálja.

Elméleti szempontból a dajkafehérjék léte tehát önmagában nem mond ellent az Anfinsen-kísérletből levont következtetés univerzális érvényének. Ugyanakkor a mai ismeretek szerint a fehérjék egy kis hányada kizárólag dajkafehérjék segítségével képes feltekeredni. A térszerkezeti információ ezek esetében is a primer szerkezetben kódolt, de önállóan nem tud érvényre jutni, csak dajkafehérjék segítségével. Másképpen fogalmazva, bár a feltekeredésnek termodinamikai gátja nincs, kinetikailag (tehát időben) a natív szerkezet elérése (a termodinamikai egyensúly beállta) csak nagyon lassan történne meg segítőfehérjék nélkül.

5.26. ábra: AGroES/GroEL komplex (chaperonin)térszerkezete (PDB:1AON)