Az elektronmikroszkópos mikrotechnika sok szempontból hasonló a fénymikroszkópos mintaelőkészítéshez, és történelmileg abból is alakult ki. Mivel a nagy feloldóképesség a legfinomabb mintakezelést igényli, szóba sem jöhetnek a koagulatív fixálószerek. Elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz a rutin fixálószer glutáraldehid a fehérjék térhálósítására, és ozmium-tetroxid a lipidek fixálására. Ez utóbbi további előnye, hogy egyben kontrasztanyagként is működik, az ozmium erős elektronszóró képessége miatt. A fixálandó anyagnak igen kisméretűnek kell lennie (egyik irányban maximum 2 mm), mivel a fixálószer penetrációja lassú, és ez vastagabb minta esetén rossz fixálást eredményezne. A fixálást mosás, majd víztelenítés követi. Ezután a mintát műgyantával kell átitatni (főként epoxy, speciális esetben metakrilát), kiöntő formába helyezni, és polimerizáltatni. A minta metszését (epoxy gyanta esetén) ún. káddal ellátott üveg, vagy gyémánt késsel végezzük. Ennek lényege, hogy a vágás során a metszet ráúszik a kádban levő víz felszínére, ahonnan könnyen összegyűjthető az elektronmikroszkóp mintatartójául szolgáló apró rácsra (mikrostély vagy grid).
Ultramikrotóm és vezérlő egysége (balra).
Száraz üvegkés, és csónakkal szerelt gyémántkés.A metszést az üvegkés tört élével, illetve a csiszolt és fémházba foglalt gyémánttal (csillogó rész) végezzük.
Metszés ultramikrotómmal, gyémántkéssel.
A sejtek vizsgálatának módszertani alapjai
Az ultramikrotómmal készített metszetek 3 mm átmérőjű mikrorostélyokra (grid) kerülnek.A gridek rácshálózata sűrűségében, azaz lyukméretében is különböző lehet. A különböző méretű beágyazott anyagokból
készült és ezért eltérő méretű metszeteket a megfelelő lyukméretű rostélyra kell „felvenni”.
Ultramikrotómmal készített metszet a mikrorostély rácshálózatára kiterítve(kis nagyítású TEM fotó a grid egy részletével).
Az összegyűjtött metszeteket még uranil-acetáttal és ólom-citráttal kontrasztosítjuk (festjük), hogy a TEM-ben megfelelő kontrasztú képet kapjunk. Minél több nehézfémsó kötődik egy adott struktúrához, annál több elektront fog elnyelni, szórni, eltéríteni az eredeti irányából. Ezek a részletek sötéten jelennek meg a képen, vagyis elektrondenzek.
A scanning elektronmikroszkópos mintaelőkészítés csak az első lépésekben hasonlít a TEM-es preparáláshoz. A minta mérete itt nem korlátozó tényező, hiszen csak a felszín jó megőrzése a feladat. A fixálószer kiválasztása sem mindig kritikus. A víztelenítés után a SEM-es vizsgálatokhoz a mintát egy igen vékony vezetőképes réteggel kell bevonni, egyébként a belőtt elektronok nem vezetődnének el, és a minta töltődése nagyon lerontaná a képalkotás lehetőségét. A mintát legtöbbször arannyal, szénnel, vagy palládiummal (esetleg ezek keverékével) vonjuk be, úgy, hogy a fémet nagy vákuumban a mintára gőzölögtetjük. A vákuum miatt a mintának teljesen száraznak kell lennie. (Egyébként a hagyományos mikroszkópokban is, akár TEM, akár SEM nagy vákuum van, mivel az elektronok a levegőben szóródnának.) A minták kiszárítását általában a kritikus pont szárító berendezéssel végezzük. A folyamat lényege, hogy minden anyagnak van egy olyan, ún. kritikus pontja a nyomás-hőmérséklet diagramon, amely értékek felett a folyadék és gáz fázis nem különíthető el, vagyis a felületi feszültség megszűnik. Ez lehetővé teszi a mintából az adott anyag elpárologtatását oly módon, hogy közben a felületi feszültség okozta struktúraváltozások elkerülhetők. Mivel a széndioxid kritikus pontja viszonylag könnyen elérhető (7,38 MPa =
73,8 bar és 31,1°C) a víztelenítő anyagot folyékony széndioxidra cseréljük ki, és ezt párologtatjuk el a készülékben.
Ezek után a száraz minta már fémgőzölhető és SEM-ben vizsgálható.
Kriotechnika
Az elektronmikroszkópos mintaelőkészítés egy alternatív lehetősége a minta hirtelen lefagyasztása és bizonyos lépések alacsony hőmérsékleten történő kivitelezése. A kriofixálás során a mintát olyan gyorsan kell lehűteni, hogy a benne levő víz ne tudjon jégkristályokká alakulni, hanem eredeti formájában szilárduljon meg, vitrifikálódjon.
A jégkristályok ugyanis nagyobb térfogatúak, mint a víz és a kristályképződés is struktúra-roncsoló hatású. Ehhez a mintát 108fok/s sebességgel kell hűteni, ami csak a felszíni kb. 5–10 µm vastagságú rétegben valósítható meg normál körülmények között. A nagy nyomású kriofixáló berendezésekkel ez a vastagság kb. egy nagyságrenddel növelhető. A kriofixálást általában folyékony nitrogén hőmérsékletére (-196°C) lehűtött propánnal végzik, mivel ez hatékonyabban hűt, mint az állandó forrásban levő, és ezért gőzbuborékokat képző folyékony nitrogén. A folyékony nitrogén hőmérsékletén gyakorlatilag minden reakció leáll, ezért ideális fixálási módszer. A kérdés az, hogyan lehet a kriofixált anyagot vizsgálatra alkalmassá tenni. A legmodernebb és egyben legköltségesebb megoldás, ha a mintát egyáltalán nem engedjük olyan hőmérsékletre felmelegedni (kb. -100°C), hogy a kristályosodás megtörténjen. A mintát ekkor alacsony hőmérsékleten kell metszeni és speciális elektronmikroszkópban vizsgálni.
Mivel ilyenkor a mintában nincsenek nehéz atomok, a képalkotás is speciális módon történik. Lehetőség van azonban arra is, hogy a mintából a vitrifikált vizet eltávolítsuk anélkül, hogy az átkristályosodna. Ehhez vagy alacsony hőmérsékleten ki kell oldani (freeze substitution) vagy vákuumban el kell szublimáltatni (freeze drying).
Az így előállított mintákat ezután már a hagyományos mikrotechnikai eljárásokkal lehet beágyazni, és metszeni.
A kriotechnikákhoz tartozik az a gyakorlati szempontból (immuncitokémia) fontos módszer, amikor magát a metszést alacsony hőmérsékleten végezzük, annak ellenére, hogy a fixálás nem alacsony hőmérsékleten történt.
A mintákat szacharóz oldattal itatjuk át, ami meggátolja a jégkristályok kialakulását, és egyben könnyen metszhető fagyott állapotban. A kriomikrotómmal így előállított metszetek felolvasztást követően jelölhetők antitestekkel, és kiszárítás után vizsgálhatók az elektronmikroszkópban. Az elektronmikroszkópos immuncitokémiához az antitesteket néhány nm átmérőjű aranyszemcsékkel jelölik meg, melyek erősen elektronszórók, és így kontrasztos fekete pöttyökként jelennek meg a mikroszkópi képen. (Metakrilát gyantába ágyazott mintából készült metszetek is alkalmasak immuncitokémiai jelölésre, de eredményességük messze elmarad a kriometszett anyagokétól.)