A sejt struktúráját, a sejtorganellumok szerkezetét, kiterjedését, alakját, mennyiségét és elhelyezkedését fény- és elektronmikroszkóppal is lehet vizsgálni. Azonban a sejt alkotóelemeinek kémiai összetételéről, az egyes sejtalkotók működéséről részletesebb ismerteket lehet gyűjteni úgy, hogy ha az organellumokat izoláljuk a sejt többi alkotóelemétől és előállítjuk tisztított, dúsított frakcióikat (sejtfrakcionálás).
A sejtalkotók és bizonyos makromolekulák frakciókban történő elkülönítésére egyes fizikai tulajdonságaikban (pl.
méretükben, alakjukban, sűrűségükben) megmutatkozó különbségeket lehet kiaknázni. Ehhez sejttenyészetből vagy valamely szervből vett minta egyaránt alkalmas lehet. A legmegfelelőbb az olyan szervből származó minta, amelynek sejtállománya túlnyomó többségében azonos sejttípusból áll, és relatíve kevés kötőszöveti rost található benne. Ilyen szerv például a máj vagy az izom.
Az eljárás alapvetően két fő szakasza a homogenizálás, azaz a sejt megbontása, feltárása a sejtalkotók hozzáférhetővé tételére, valamint a „centrifugálás” vagyis a sejtorganellumok centrifugális ülepítéssel történő elválasztása a frakciók előállítására.
Homogenizálás
Szervekből, szövetekből származó minták esetében a sejteket szöveti kötődésükből (sejt–sejt, és sejt–ECM kapcsolatok!) fel kell szabadítani. A sejtfelszíni molekuláris kapcsolatokat és a sejtkapcsoló struktúrákat bontani kell. Ez megfelelő ion-összetételű oldatok, enzimek, mechanikai behatás vagy ezek kombinációja alkalmazásával valósítható meg.
A sejtalkotók a sejt "feltárásával" válnak hozzáférhetővé. Ez a sejthártya felszakításával és a sejtváz feldarabolásával érhető el, ennek megvalósítására mechanikai, fizikai, fizikai-kémiai módszerek alkalmazhatók. Az alábbi módszerek többségénél a sejtalkotók egy része sérül, különösen a kiterjedt kompartimentumok (pl. SER, DER) feldarabolódnak, összefüggő membránjaik vezikulákká tagolódnak (vezikularizáció).
Hipozmotikus oldatba helyezve a sejteket(ozmotikus sokk), a membránnal határolt terekbe víz áramlik be, ami a membránnal határolt terek megduzzadásához, végül a membrán felszakadásához vezet.
A konyhai turmixgép működési elvére épülő, de speciális kiképzésű ún.késes homogenizátorkülönösen detergens és/vagy szerves oldószerek alkalmazásával kombinálva makromolekulák (pl. DNS) szeparálására is alkalmas.
Azultrahanggaltörténő kezelés alkalmas a sejtfal széttörésére is, gyakran sejtkultúrák, sejtszuszpenziók sejtjeinek feldolgozásához használják. Az ultrahangos homogenizátorral jó eredménnyel nyerhető ki egy tisztított sejtfrakció organellumainak beltartalma.
Sejtszuszpenzió kisméretű résen, meghatározott nyomással történő átpréselésekor („french press”) a sejtekre ható nyírófeszültség és a nyomásváltozások hatására szakad fel a sejthártya.
A sejtekre ható nyírófeszültséget és a kialakuló folyadékelegy belső súrlódását használja fel a sejtek feltárására a Potter-Elvehjem homogenizátor. Ez egy üvegcsőből és a csőbe precízen illeszkedő csiszolt üveg vagy teflon dugattyúból áll. A dugattyú kézzel (kis mennyiségek feldolgozásához) vagy motorral (5 ml-es mintatérfogat felett) mozgatva a tengelye körül forgatható. A csőbe helyezve a kisebb szövetdarabokat tartalmazó mintát vagy sejtszuszpenziót, a dugattyú forgatása közben az anyagot többször át kell préselni a cső és a dugattyú fala közötti résen. Ennek hatására a szervdarabkák szétesnek, a sejtek felszakadnak, a sejtorganellumok kisodródnak. Sokoldalú, több paraméterében jól szabályozható, ezért széles körben alkalmazott módszer.
Potter-Elvehjem homogenizáló cső és teflon dugattyúja.
A Potter-féle homogenizáló működési elve.
A kialakuló szuszpenzió, a homogenizátum, diszperz rendszer, melyben sejttöredékek, a sejtorganellumok és töredékeik, a sejtközötti állomány elemei találhatók meg. A csak sejtekből, szövetekből, szervdarabokból készített homogenizátum túl sűrű (túl nagy belső súrlódású) lenne, ezért a feltárás előtt a feldolgozandó anyaghoz ún.
homogenizáló médiumot kell adni (1 g mintához 3–5 ml médium). A homogenizáló médium – rendkívül leegyszerűsítve – modellezi a sejten belüli körülményeket: tartalmaz egy- és kétértékű kationokat, aniont, puffer-komponenst (a pH beállítására) és a megfelelő ozmolalitás beállítására szolgáló vegyszert (általában szacharóz, céziumklorid stb.).
A homogenizálás lehet „enyhe” vagy „durva”. Előbbi esetben a sejteket, sejtalkotókat gyengébb behatásnak tesszük ki, a sérülékenyebb organellumok jól megtarthatók, de a sejtek feltárása nem egyenletes, nagyobb sejtrészletek megbontatlanul maradhatnak. A durva homogenizálás eredménye egy egyenletes feltárás, de ennek ára az érzékenyebb organellumok nagymértékű sérülése. Ez utóbbi esetben a sérült sejtalkotókból kiszabaduló anyagok más frakciókat szennyeznek.
A sejtek vizsgálatának módszertani alapjai
Patkány hasnyálmirigyből enyhe homogenizálással készített preparátum.A DER ciszternái nem váltak el egymástól és a sejtmagtól.
Májból előállított DER frakciójól mutatja az erős homogenizálás hatására lejátszódó vezikularizáció eredményét.
A homogenizátum előállítása során gondoskodni kell a kiszabaduló enzimek aktivitásának gátlásáról alacsony (közel 0°C) hőmérséklet biztosításával, szükség esetén enzimgátlók (pl. hasnyálmirigyből vett minta feldolgozásánál tripszin inhibitor) hozzáadásával.
A homogenizátumból centrifugális ülepítéssel nyerhetők ki a különböző sejtalkotók frakciói.
Centrifugálás
A homogenizátumban a sejtalkotók részecskéinek mozgását alapvetően a nehézségi erőtér, illetve az ülepítő közegben fellépő súrlódási erők határozzák meg. A tényleges mozgást befolyásolja a részecskék mérete (térfogata), alakja (felülete) és sűrűsége, pontosabban az ülepítő közeg és az ülepedő részecske sűrűsége közötti különbség.
Az ülepítő közegnél nagyobb sűrűségű részecskék a nehézségi erő irányába haladva ülepednek (szedimentáció), a közegnél kisebb sűrűségűek pedig ellentétes irányban elmozdulva fölöződnek (flotáció). Az ülepedés (vagy fölöződés) sebessége egyenesen arányos a részecske és a közeg sűrűségkülönbségével, négyzetesen arányos a részecske méretével és fordítottan a közeg belső súrlódásával. Mivel a sejtorganellumok és töredékeik a kolloid mérettartományba tartoznak (átmérőjük: 1 nm–0,5 µm), ezért részecskéik sebessége még viszonylag nagy sűrűségkülönbség esetén is nagyon csekély. Ezen túlmenően az 1 µm és ennél kisebb átmérőjű részecskék hőmozgása már érzékelhető mértékben a gravitációs mozgás ellen hat. Ezért a gyakorlatban a sejtorganellum frakciók előállítására a normál nehézségi erőtér alkalmazása csak igen korlátozottan felel meg.
A megoldás az ülepedési (fölöződési) sebesség megnövelése centrifugális erőtér alkalmazásával. Az erre a célra kifejlesztett eszközök a laboratóriumi (és ipari) centrifugák, melyek közül még a legkisebbek is a nehézségi erőtérnél nagyságrenddel nagyobb centrifugális erőtér létrehozására képesek. Sejtfrakcionálási feladatokhoz az ún. preparatív ultracentrifuga a legalkalmasabb. (Ultracentrifugának nevezik a 20 000/perces fordulatszámnál nagyobb teljesítményű centrifugát.)
Azt, hogy a forgástengelytől mért adott távolságban a centrifugális gyorsulás hányszorosa a nehézségi gyorsulásnak a relatív centrifugális erőtérrel (RCE) fejezik ki. A gyakorlatban alkalmazott centrifugális gyorsulás a nehézségi
állandó 102–105-szeres tartományába esik, ilyen körülmények között a hőmozgás és a gravitációs mozgások ülepítés vagy fölöződés ellen ható komponensei elhanyagolhatóak!
A közegnél nagyobb sűrűségű (ülepedő) részecskék centrifugális, míg a közegnél kisebb sűrűségű (fölöződő) részecskék ezzel ellentétes irányú centripetális mozgást végeznek. A részecskék sebessége egyenes arányban nő a forgási tengelytől mért távolsággal, illetve a fordulatszám négyzetével.
A centrifugálásos elválasztási módszer elméleti alapjait megadó egyenletrendszer a gravitációs mozgást, a súrlódási erőt (Stokes-egyenlet) és a centrifugális gyorsulást leíró egyenleteken alapszik. A felhasznált összefüggéseket ideális rendszerre vonatkoztatjuk: a részecskék 50 nm körüliek, gömbszerűek, a közeg sűrűsége (kb. 1 g/cm3), viszkozitása (kb. 1 centipoise), mely a 20°C-os vízével egyező. (A valóságban a sejtfrakcionáláskor az ülepítendő részecskék mérete széles skálán szórhat, alakjuk jelentősen eltérhet a gömbétől.)
A centrifugális erőtérben ülepedő (fölöződő) részecske fontos jellemzője egységnyi szöggyorsulására vonatkoztatott ülepedési (vagy fölöződési) sebessége, amit a részecske ülepedési együtthatójának (szedimentációs koefficiensének) neveznek. Jele: s, dimenziója szekundum, értékének nagyságrendje vizes közegben és makromolekulák esetében 10–13 s, amit nagyobb részecskék, pl. sejtorganellumok esetében – kényelmi okokból – 1013-szorosában, ún.
Svedbergben (S) fejezünk ki (S=10-13s). Például az eukarióta riboszóma kis alegységének ülepedési együtthatója 40S, azaz s=4x10–12.
Theodor Svedberg (1884–1971) svéd fizikokémikus;a diszperz rendszereken végzett kutatásaiért kapott Nobel-díjat 1926-ban. Munkásságával alapvetően hozzájárult a fehérjemolekulák centrifugális ülepedési sebességének
és ezáltal molekulatömegének mérésére alkalmas analitikai ultracentrifugálás technikájának kifejlesztéséhez, A gyakorlatban a percenkénti fordulatszámot (RPM– revolutiones pro minutum), a centrifugálás idejét percekben (vagy órákban), és azRCEértékét (általában 1000xg-ben kifejezve) adják meg.
Balra fix mintatartó állású szögrotor, jobbra a fordulatszám növelésére az erőhatásoknak megfelelően kilendülő mintatartókkal az ún. kilendülő rotor(a rotortartó talpakon).