A sejtek kémiai komponenseinek kimutatásával a citokémia foglalkozik. A citokémiában alkalmazott módszerek lényege olyan eljárások, protokollok kidolgozása, amelyek alkalmasak a kiválasztott vegyület sejten belüli elhelyezkedésének (lokalizációjának) feltárására, azonosítására. A módszerek alapja olyan (akár több lépésből álló) kémiai vagy biokémiai reakció, amelyben a képződő reakciótermék csapadék (nem oldódik fel és nem diffundál el képződésének helyétől) és mikroszkópban jól látható (színes vagy elekrondenz). A korai módszerek a sejtek makromolekuláinak és szervetlen alkotóelemeinek közvetlen kimutatására, azonosítására szolgáltak (leíró hisztokémia).
A sejtek vizsgálatának módszertani alapjai
Szénhidrát-kimutatás PAS festéssel(PAS – perjódsav–Schiff-reagens) egér utóbél metszetén. A püspöklila szín jelzi a magas szénhidráttartalmú váladék elhelyezkedését a metszeten.
A módszertan fejlődésének és a kutatások igényeinek megfelelően a sejtekben végbemenő folyamatok kimutatására, nyomon követésére indirekt eljárások is megjelentek (funkcionális hisztokémia). Ez utóbbi esetben pl. enzimeket ismert reakciómechanizmusuk alapján (enzimcitokémia), egyedi fehérjéket pedig immunológiai módszerrel (immuncitokémia) mutathatunk ki.
Enzimcitokémia
A XX. század első felében a sejttani kutatások eredményeképpen a gyorsan fejlődő biokémiai kutatások során számos enzim, enzimrendszer azonosítására került sor. Hamar kialakult az a kép, hogy a sejt anyagcseréjét a legegyszerűbb folyamattól a legbonyolultabbig az enzimek katalizálják. Az enzimológiai kutatások jelentőségét az anyagcsere-folyamatok feltárásában, és megértésében elért eredmények támasztják alá. Az enzimek sejtekben történő kimutatására kidolgozott ún. enzimcitokémiai módszerek a XX. század második felében, az 1980-as évekig hódítottak, de jelentőségüket a mai napig sem veszítették el.
Az eljárások alapja az, hogy a sejtben vagy sejtközötti állományban elhelyezkedő enzimet olyan szubsztráttal reagáltatjuk, amellyel reakcióba lép, és a képződő reakciótermék a preparátumban azonosítható, megfigyelhető.
A preparátum elkészítése (mintavétel, metszetkészítés) során alkalmazott mikrotechnikai lépések hátrányos hatásai ellenére a készítményben találhatók olyan enzimek, melyek működőképességüket megtartották. Ebben az esetben megfelelő körülmények (hőmérséklet, pH, ionkoncentráció, kofaktorok) biztosításával aktiválhatók, és megfelelő szubsztrátjuk (oldhatatlan csapadékot ad, az adott enzimfehérjére nézve specifikus, nem bomlik el spontán) hozzáadásával egy vagy több lépésben színes csapadék képeződhet. A csapadék elhelyezkedése az aktív enzim lokalizációját jelzi.
Gömöri lúgos foszfatáz kimutatása a vesetubulusok sejtjeiben egér vese hosszmetszetén. A sejtek nem ismerhetőek fel, mert az alkalmazott nagyítás ehhez túl kicsi.
Az enzimek kimutatására szolgáló eljárások alapvetően négy csoportba sorolhatók:
1. A szubsztrát a reakció eredményeképpen színtelen reakciótermékké alakul át. Utóbbi a szubsztráttal együttesen alkalmazott vegyülettel pillanatszerűen lejátszódó reakciója során alakul át színes, oldhatatlan csapadékká.
2. Ha az enzim és szubsztrát kölcsönhatás eredménye egy színtelen, de oldhatatlan vegyület, akkor a színes csapadék kialakítására az enzimreakciót követően is van lehetőség.
3. A szubsztrát oldhatatlan, színes csapadékká alakul az enzimreakció hatására. Az alkalmas szubsztrátok száma igen korlátozott!
4. Az enzimek irreverzibilisen blokkolhatók aktív centrumaikhoz kovalensen kötődő inhibitorokkal. Az inhibitorhoz jelzőmolekulát kötve a gátolt enzim lokalizációja igen pontosan azonosítható. Speciális laborigényei miatt ritkán alkalmazott módszer.
Bár élő állapotú mintán is lehet enzimcitokémiai vizsgálatot végezni, de ilyen mintákon sok a téves reakció, hamis háttérjelölődés. A minta fixálása alapvető fontosságú. Olyan rögzítőszert kell használni, mellyel biztosítható az enzimek azonnali irreverzibilis immobilizációját, de az enzim aktivitásának megőrzésével. Enzimcitokémiai eljárásokban rögzítőszerként legelterjedtebben pufferelt formaldehid- és/vagy glutáraldehidet, alkalmaznak.
Lényeges a fixálószer gyors penetrációja.
Az alábbi három képből álló sorozaton harántcsíkolt izom azonos területéről készült keresztmetszeti készítményeken ATP-áz aktivitásának kimutatása tanulmányozható. Az enzimreakció sötétbarna csapadék képződésével jár. A képek abban különböznek, hogy a szubsztráttal történő inkubálás eltérő pH-n zajlott. Ezért a képeken eltérő pH optimumon működő ÁTP-áz enzimek reakciója, és lokalizációja mutatkozik meg. Így lehetségessé válik pl. az eltérő miozin fehérjék kimutatása.
ÁTP-áz aktivitás kimutatása; pH=4,2.
ÁTP-áz aktivitás kimutatása; pH=4,6.
A sejtek vizsgálatának módszertani alapjai
ÁTP-áz aktivitás kimutatása; pH=10,2.
Az enzimcitokémiai eljárás műtermék(ek) képződésével járhat (elégtelen vagy hibás fixálás, a keletkező csapadék kioldódik stb.), így a készítmények kiértékelésénél fokozott óvatossággal kell eljárni, és az enzimreakció specifitását kontroll preparátumokkal kell igazolni. A kontroll lehet pozitív, amelyben az alkalmazott enzimreakció biztosan (bizonyítottan) lejátszódik, ezzel lehet igazolni az alkalmazott reakció működését. A negatív kontrollal lehet kizárni a hamis eredményeket: a szubsztrát kihagyásával vagy specifikus gátlószerek alkalmazásával vagy az enzim hővel történő inaktiválásával elméletileg a csapadékképződés elmarad.
Az enzimcitokémia alkalmazható elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz készített metszeteken is. A hiteles eredmények eléréséhez fokozottan kell ügyelni a minta ultrastruktúrájának megőrzésére, a megfelelő elektrondenz csapadék biztosítására (pl. fémsók alkalmazásával), és a csapadék diffúziójának kizárására (pl. alacsony hőmérséklet alkalmazásával).
Elektronmikroszkópos enzimcitokémia.Savas foszfatáz kimutatása lizoszomális apparátus elemeiben (elektrondenz struktúrák; Kis Viktor felvétele).
Immuncitokémia
Az utóbbi 25–30 évben egyre szélesebb körben alkalmazott, az immunbiológiai módszerek családjába tartozó eljárás. Alapja az antigén-antitest reakció, vagyis az, hogy az antitestek nagy specifitással kötődnek azon molekulákhoz, amelyekkel szemben termelődtek. Az antitest (immunglobulin típusú vérfehérje) e tulajdonságát lehet felhasználni arra, hogy egy sejtben, egy metszeten vagy esetleg sejttenyészetben a megfelelő antigének jelenléte, lokalizációja nagy pontossággal kimutatható legyen.
Antigénlehet minden nagy molekulasúlyú vegyület (fehérjék, peptidek, egyes lipidek, szénhidrátok), leggyakrabban valamely fehérje. (Antigén céljára kis molekulatömegű anyagok is felhasználhatók: megfelelő hordozómolekulákhoz kötve, az így kialakított molekulával szemben könnyen termeltethető immuncitokémiai célra felhasználható antitest.) A módszer lényege, hogy a kimutatandó anyagot, pl. fehérjét egy állatból (pl. patkány) izolálják és tisztítják, majd bejuttatják egy másik állatfaj (pl. nyúl) szervezetébe. A patkányból származó fehérjét a nyúl immunrendszere antigénként azonosítja, majd ellenanyagot (primer antitest) képez ellene. A termelődő antitestet a nyúl véréből
kivonják, tisztítják. Ez az antitest patkányból származó mintán specifikusan kötődhet a megfelelő fehérjéhez (antigénhez). A kötött antitestek nem láthatók, ezért azokat mikroszkóposan is azonosítható jelöléssel kell ellátni.
Ha a jelölést közvetlenül a primer antitesthez kötjük, akkordirekt immuncitokémiai jelölést alkalmazunk. A jelölés lehet egy enzim, ekkor az antitestet enzimcitokémiai módszerekkel lehet láthatóvá tenni, a minta a kialakuló csapadék tulajdonságaitól függően fény- vagy elektronmikroszkópban vizsgálható. E célra gyakran a peroxidáz-reakciót alkalmazzák, mely már igen kis jelölődés mellett is diaminobenzidin (DAB) és hidrogénperoxid jelenlétében intenzív barna, oldhatatlan reakcióterméket ad. A jelölés lehet egy fluoreszcens festékmolekula (ún. flourofór, pl.
fluorescens izotiocianát – FITC) is, ez esetben a minta fluoreszcens mikroszkóppal tanulmányozható. A direkt eljárás előnye, hogy egyszerűen és gyorsan kivitelezhető, de relatíve sok antitestet igényel, és magas lehet a téves háttérjelölés.
Az antitest Y alakú molekula, melyek két karja tartalmazza a variábilis antigén kötőhelyeket. A molekula szára több olyan konzervatív, az adott fajra jellemző szekvenciát tartalmaz, melyekkel szemben további antitestek termeltethetők. Ezért az így előállított (másodlagos) antitest a primer antitestet szolgáltató fajból előállított antitestek jelölésére felhasználható.
A direkt immuncitokémiai jelölés sémája.
Az indirekt immuncitokémiai jelölés sémája.
Ha a nyúlból származó (primer) antitestet egy harmadik állatfaj egyedébe (pl. kecske) juttatjuk, akkor az ott antigénként jelenik meg és ellenanyag-képződést (szekunder antitest) indukál. A szekunder antitest specifikusan fog kötődni a primer antitest megfelelő régiójához. A patkányból származó mintán a nyúl szervezetéből kivont primer antitest specifikusan kötődik az antigénjéhez (a patkány adott fehérjéjéhez), a jelölőmolekulával összekapcsolt szekunder antitest szintén specifikusan kötődik a primer ellenanyaghoz. Ez azindirekt immuncitokémiai eljárás.
Az eljárás munkaigényes, de egy primer antitesthez több szekunder antitest is kötődhet, így a jelölés erősebb, a módszer érzékenyebb, mint a direkt eljárásnál. Az indirekt eljárások között számos többlépéses protokollt dolgoztak ki. A többlépéses immuncitokémiai reakciósor lehetőséget biztosít az antigénkimutatás érzékenységének növelésére.
Az immuncitokémiai vizsgálatokat elektronmikroszkópos mintákon is lehet végezni, ha a jelölésre használt reakciótermék megfelelő elektronelnyelő komponenst is tartalmaz. Ez lehet enzimreakció eredményeképpen létrejövő nehézfémtartalmú (pl. ozmium) csapadék, vagy a szekunder ellenanyaghoz adszorbeáltatott meghatározott mérettartományba eső (1–15 nm átmérőjű) kolloidális aranyszemcse („immunogold” eljárás). Előbbi esetben a nehézfémet tartalmazó csapadék, az utóbbiban a szabályos és egységes méretű aranyszemcsék árnyéka jelöli az antigén helyét a metszeten.
A sejtek vizsgálatának módszertani alapjai
Immunogold eljárással jelölt elektronmikroszkópos immuncitokémiai készítmény.Májsejt váladékszemcséjén látható kerekded fekete pöttyök az aranyszemcsék képei. A mintán két, eltérő méretű aranykolloiddal jelölt antitest
lokalizációja látható (kettős jelölés).
Természetesen az immuncitokémiai eljárások során is keletkezhetnek hamis jelek (pl. az alkalmazott antitestek aspecifikus kötődésével, keresztreakciók kialakulásával), melyeket megfelelő kontroll alkalmazásával lehet az eredmények értékelésénél figyelembe venni.
Kérdések:
20. Csoportosítsa az enzimek kimutatására szolgáló eljárásokat!
21. Mi az antigén–antitest reakció lényege?
22. Milyen molekulák alkalmasak antigénként történő felhasználásra?
23. Mi az eljárásbeli különbség a direkt és indirekt immuncitokémiai eljárások között?
24. Mi a jelentősége az indirekt eljárásban használt szekunder antitestnek alkalmazásának?
25. Mi az előnye az indirekt eljárásnak?
26. Mekkora lehet a jelöléshez felhasznált kolloidális aranyszemcsék mérete?
27. Milyen eszközzel lehet tanulmányozni az immunogold eljárással készített preparátumokat?
28. Miért alkalmas az aranykolloid jelölés elektronmikroszkópos minta kezelésére?