18. ára: A S-tartalmú komponensek koncentrációjának és a reakcióelegy pH-jának időbeni változása
5.2.7. Az L-fenilalanin fotokatalitikus reakciói
Az L-fenilalanin aromás gyűrűt tartalmazó apoláris oldalláncú vegyület, a fotokatalitikus reakciók tanulmányozása szempontjából kitüntetett sajátságúnak tekinthető, ugyanis mind a három funkciós csoportja reakcióba léphet a katalizátor gerjesztésekor keletkező reaktív ré-szecskékkel:
(i) az aminocsoport képes a gerjesztett félvezető vezetési sávjából elektront „átvenni”,
Relatív intenzitás
Hullámszám (cm-1)
Relatív intenzitás
Hullámszám (cm-1)
(ii) a karboxilcsoport a vegyértéksávban képződő, illetve a felületen csapdázott lyuknak adhat át elektront,
(iii) a fenilcsoportot a lyuk és a vízmolekulák, vagy a lyuk és a hidroxidionok reakciójá-ban keletkező hidroxilgyök támadhatja meg.
Az aromás vegyületek teljes mineralizációját eredményező fotokatalitikus reakciólépések közül a legfontosabbnak tekinthető az, amelyik a gyűrű felnyílásához vezet. Ez még ma is vitatott kérdés. A fenilalanin vizes szuszpenziójának anaerob és aerob körülmények között végzett megvilágításakor kapott kísérleti adatok alapján igyekeztünk erre is választ adni. A lejátszódó reakciókat a korábban ismertetett analitikai módszereken túl a spektrális változások (fényelnyelés és lumineszcencia) megfigyelésével és értékelésével is nyomon követtük [148].
5.2.7.1. Spektrális változások az L-fenilalanin heterogén fotokatalízisekor
A vegyület fényelnyelési színképében, az UV tartományban az aromás rendszerre jellem-ző π→π* átmenethez tartozó sáv a reakcióelegy bevilágításakor jellegzetes változást mutat (33. ábra).
A. argon B. levegő
33. ábra: A fényelnyelés változása a fenilalanin fotokatalízisekor.
● – 258 nm, ● – 280 nm, ● – 298 nm, ● – 350 nm
Argon atmoszférában a fényelnyelés nő, a finom sávszerkezet fokozatosan eltűnik, na-gyobb hullámhosszaknál (280 nm, 298 nm, 350 nm) új sávok jelennek meg (33.A. ábra).
Levegővel telített elegyekben a fényelnyelés gyorsabban nő, a finom sávszerkezet 3 órás bevilágítás alatt teljesen megszűnik (33.B. ábra), majd ezt követően csökken az abszorbancia.
Az aromás aminosav színképére jellemző hullámhossz-tartományban (240-270 nm) tapasztalt abszorbancia-növekedés oka, hogy a keletkező köztitermékek – hidroxi-aromás vegyületek – fényelnyelése intenzívebb, mint a fenilalaniné (11. melléklet). Koncentrációjuk, azaz fényel-nyelésük növekedése túlkompenzálja az eredeti sáv csökkenését.
A 280 nm körül mérhető jelentős abszorbancia-növekedés tirozin vagy más hidroxi-fenilalanin izomer képződésére utal, ugyanis a tirozin fényelnyelési színképében gyengén savas közegben 278 nm-nél intenzív sáv található [192] (11. melléklet).
A. argon B. levegő
34. ábra: A lumineszcencia intenzitásának és hullámhosszának változása.
c(fenilalanin)0=10-3 M, c(katalizátor)=1 g dm-3, 40 dm3 h-1 argon/levegő,ℓ=1 cm, λgerj.=258 nm, rés=15 nm
A vizsgált minták emissziós színképében vörös eltolódás figyelhető meg (34. ábra). A lu-mineszcencia intenzitása és sáv maximuma argon atmoszférában határértékhez tart, sáveltoló-dás: 285 nm-ről – 306 nm-re (34.A. ábra). Levegő jelenlétében az első 20 percben az
intenzi-0
tás gyors növekedését jelentős sáveltolódás kíséri (34.B. ábra). A bevilágítást tovább folytatva az emisszió intenzitása csökken, a vörös eltolódás 100 perc után fejeződik be, mértéke ∼24 nm: 285 nm-ről – 309 nm-re. 7 óra után a reakcióelegy emittáló vegyületet nem tartalmaz (34.B. ábra).
Eredményeinket összegezve:
(i) argonnal telített szuszpenzióban a színképek kvalitatív értékelése alapján hidroxi- és dihidroxi-fenilalaninek képződése és felhalmozódása sejthető (33.A és 34.B. ábra),
(ii) levegővel telített szuszpenzióban a hidroxi- és dihidroxi-fenilalaninek köztitermék jellege és teljes mineralizációja is kimutatható (33.B. és 34.B. ábra).
5.2.7.2. Az L-fenilalanin fotokatalitikus bomlásának nyomon követése
A folyadékfázis pH-ja argon atmoszférában gyakorlatilag nem változik, a levegő betáplá-lással végzett kísérletekben (pH0=4,5) közel 3 egységgel nő. Argonnal kevert rendszerekben 7 óra alatt az aminosav 23%-a alakul át, aerob körülmények között 300 perces bevilágítás után a kiindulási szerves anyag a mintákban már nem detektálható (35.A. ábra).
A. fenilalanin és NH4+
B. TOC
35. ábra: A fenilalanin fotokatalízisét jellemző változások.
● – fenilalanin(argon), ○ – fenilalanin(levegő), ● – NH4+
A reakcióelegy szerves széntartalma anaerob rendszerekben ∼11%-kal, míg oxigénnel telí-tett szuszpenziókban 420 perces bevilágítás alatt ∼87%-kal csökken (35.B. ábra). A fotogenerált elektron és az aminocsoport reakciójában képződő ammónia (ammóniumion) koncentrációja levegővel kevert szuszpenzióban nagyobb UV-dózisnál csökken – hasonlóan az aszparaginsav fotodegradációjakor tapasztaltakhoz (5.2.3.1. fejezet) –, a szervetlen kation lúgos közegben könnyen oxidálódik (35.A. ábra) [172]. Elsellami és munkatársai eredménye szerint is az NH4+
az elsődleges N-tartalmú termék a fenilalanin fotodegradációjakor, nitrátion képződését csak az aminosav teljes „eltűnése” után észlelték [145].
A kísérleti eredmények – ∼11%-os TOC-csökkenés, NH4+
-képződés és a spektrális válto-zások – alapján valószínűsíthető, hogy a fenilalanin fotokatalitikus bontásakor anaerob kö-rülmények között csak a vegyület alifás oldallánca degradálódik CO2-dá, az aminocsoportból NH4+
ion képződik, gyűrűfelnyílás nem történik, a fenilgyűrű hidroxileződik. Oxigén jelenlé-tében az aminosav kezdeti bomlási sebessége ∼3,5-szer nagyobb, mint argon atmoszférában – (v0(levegő)=65,0x10-7 M min-1, v0(argon)=18,5x10-7 M min-1, 8. táblázat).
8. táblázat: A kezdeti bomlási sebességek összehasonlítása.
v0 (M min-1) Kezdeti sebességek
argon levegő
v0(levegő)/v0(argon)
Fenilalanin bomlása 18,5x10-7 65,0x10-7 3,5
NH4+
-képződés 9,1x10-7 9,1x10-7 1,0
TOC-csökkenés 17,5x10-7 142x10-7 8,1
A kezdeti sebesség meghatározásának hibája: ±8%
A TOC csökkenésében O2 hatására bekövetkező növekedés (v0(levegő)/v0(argon)=8,1) nagyobb mértékű, mint a fenilalanin koncentrációjának (v0(levegő)/v0(argon)=3,5) csökkené-sében tapasztalható változás (8. táblázat). Aerob rendszerekben a reakcióelegy széntartalmá-nak időbeni alakulása két szakaszra bontható, az első két órában észlelt csaknem állandó se-bességű csökkenés után felgyorsul a TOC változása, ami a mineralizáció előrehaladásával természetesen ismét lelassul. Feltételezzük, hogy az első szakaszban az alifás lánc degradáló-dik és ezzel párhuzamosan a fenilgyűrű hidroxileződegradáló-dik, a köztitermékek mennyisége nő, szén-tartalmuk maximális koncentrációja 3,0-3,3 mM (35.B. ábra). Ezt követően, valószínűleg a hidroxileződött köztitermékek és az oxigén-tartalmú (pl. O2•-, HO2• és/vagy O2(1∆g)) aktív
részecskék reakciójában következik be a gyűrű felnyílása, majd az alifás intermedierek is mineralizálódnak.
Argonnal és levegővel kevert rendszerekben egyaránt megfigyelhető, hogy az NH4+ kez-deti képződési sebessége kisebb, mint a modellvegyület eltűnési sebessége (8. táblázat). En-nek legfőbb oka, hogy az NH3(NH4+
) képződésével párhuzamosan a fotogenerált lyuk és az aminosav karboxilcsoportjának reakciója, továbbá a fenilcsoport hidroxileződése is bekövet-kezik. Ráadásul a katalizátor gerjesztését követően a vezetési sávból a protonált aminocsoportra irányuló elektronátmenet után az ammóniavesztés különböző mellékreakci-ókkal verseng – hidrogénatom képződése és elektronátadás a vegyértéksávba –, melyek csök-kentik az NH4+
koncentrációját. Meglepő, hogy az ammóniumion-képződés kezdeti sebessége anaerob és aerob körülmények között azonos (8. táblázat). Czili Hajnalka és munkatársa ha-sonló eredményt kaptak a triklórecetsav fotodegradációjának vizsgálatakor a kloridion elvesz-tésére [193]. A jelenséget az oxigénmolekulának a gerjesztett TiO2 felületén tapasztalt elekt-ronközvetítő tulajdonságával magyarázhatjuk. A feltételezés értelmében a szuperoxid-gyökanion képes elektront továbbítani a félvezető felületén adszorbeálódott molekulákhoz, pl.
a fenilalanin vagy a triklórecetsav elektrondonor csoportjához (–NH3+, –Cl). A dioxigén ilyen szerepének jelentőségére Gimenez és munkatársai hívták fel a figyelmet, akik a kromátionok fotokatalitikus redukcióját tanulmányozták TiO2 félvezető részecskéket tartalmazó reakció-elegyekben [194].
Aerob körülmények között az NH4+ képződési sebessége 3 óra után jelentősen megnő (35.A. ábra), a fotokatalízis e szakaszában történik meg a gyűrű felnyílása (30.B. ábra). Az eredmények azt is sugallják, hogy az NH2(NH3+)-vesztés kedvezményezettebb az alifás lánc-ról, mint az aromás gyűrűről.
5.2.7.3. Köztitermékek azonosítása HPLC-MS vizsgálatokkal
A spektrális eredmények, valamint a reaktánsok és a termékek koncentrációjának változá-sa alapján feltételezett különböző köztitermékek azonosítáváltozá-sa HPLC-MS vizsgálatokkal tör-tént.
Anaerob körülmények között bevilágított minták kromatogramjaiban a különböző retenci-ós időknél felvett MS spektrumokban található jelek:
(i) a fenilalanin m/z=166 jele,
(ii) nagy intenzitású m/z=182 és m/z=198 jelek (és fragmentumaik), amelyek valószínű-leg a hidroxi-fenilalanin, illetve a dihidroxi-fenilalanin izomerek molekulaionjaihoz tartoznak,
(iii) kisebb szénatomszámú, de aromás gyűrűt tartalmazó vegyületekre jellemző m/z jelek.
Aerob körülmények között kezelt reakcióelegyekben, amelyekben megvalósul a teljes mi-neralizáció:
(i) az aromás karbonsav jelét,
(ii) az aminosav hidroxileződött, illetve dihidroxileződött molekulaionjaihoz tartozó jeleket, (iii) különböző m/z értékű molekulaionok jeleit – valószínűleg kis molekulatömegű, ali-fás szénláncú vegyületek – találtuk meg.
Elsellami és munkatársai a fenilalanin fotomineralizációjakor képződő főbb közti- és vég-termékeket LC-MS technikával azonosították [145]:
(i) aromás gyűrűt tartalmazó vegyületeket: a hidroxi-fenilalanin három izomerjét, fenil-propionsavat, két különböző retenciós idejű izomer dihidroxi-fenilalanint,
(ii) alifás láncú vegyületeket: oxálsavat, ecetsavat, propánsavat, 2-hidroxi-propánsavat és hidroxi-imino-ecetsavat.
5.2.7.3.1. Hidroxileződött intermedierek
Standard vegyületekkel végzett ellenőrző mérésekkel igazoltuk, hogy az anaerob és az ae-rob körülmények között bevilágított minták kromatogramjaiban detektált m/z=182 jelek a hidroxi-fenilalanin (rt=2,1 perc, 2,5 perc, 3,6 perc), míg az m/z=198 jelek a dihidroxi-fenilalanin különböző izomerjeinek (rt=1,3 perc, 1,6 perc, 1,8 perc) molekulaionjaihoz ren-delhetők. A 2,1 perces retenciós idejű hidroxivegyület a 4-hidroxi-fenilalanin (tirozin), míg az 1,6 perces retenciós idejű dihidroxivegyület a 3,4-dihidroxi-fenilalanin (dopa). C18-as oszlo-pon az izomerek retenciós ideje para<meta<orto sorrendben változik [195]. Ennek megfele-lően a 2,5 perces retenciós idejű köztitermék a meta-hidroxi-fenilalanin, míg az orto-hidroxi-fenilalanin retenciós ideje 3,6 perc.
A 9. táblázatban a HPLC-MS kromatogramokban megjelenő nagyobb intenzitású jelek azonosítását mutatom be. Ezek lehetnek a fenilalanin, illetve hidroxileződött formáinak nátri-ummal alkotott vegyületei, valamint olyan fragmentumaik, amelyeket az aminocsoport, a karboxilcsoport, illetve az aminocsoport és a karboxilcsoport hidroxilcsoportjának együttes lehasadásával kaphatunk.
Fontos megemlíteni, hogy az orto- és a meta-hidroxi-fenilalaninokhoz tartozó m/z=165 fragmentumok jelei igen kis intenzitásúak. Ennek oka, hogy a vegyületek geometriája lehető-vé teszi az aminocsoport nitrogénatomja és a hidroxilcsoport oxigénatomja közötti H-híd
kö-tés kialakulását, azaz gyűrűs szerkezet létrejöttét, s így gátolt az izomerekben a C–N kökö-tés felhasadása.
9. táblázat: A HPLC-MS kromatogramokban detektált jelek azonosítása (m/z értékek).
Lehasadó csoportok Vegyület (X)
Relatív
móltömeg XH+ XNa+