Az aszkorbát szerepe az algák nem-fotokémiai kioltásában

Bevezetés: nemfotokémiai kioltás zöldalgákban

Magasabb rendű növényekben az Asc a VDE kofaktoraként szerepet játszik az NPQ folyamataiban, ezáltal fontos fotoprotektív szerepet tölt be (Bratt és mtsai, 1995; Saga és mtsai, 2010; Hallin és mtsai, 2016). A zöldalgák VDE enzime nem mutat rokonságot a növényi VDE-vel, hanem a fotoszintetizáló baktériumok likopén ciklázaihoz hasonló. A C. reinhardtii VDE enzime (CrCVDE, Cre04.g221550) a tilakoid membrán sztóma oldalán helyezkedik el, ellentétben a növények VDE enzimével, amely a lumenben található (Li és mtsai, 2016a). A CrCVDE működéséhez szükséges kofaktort vagy reduktánst még nem azonosítottak, és nem volt ismert, hogy az Asc közvetve vagy közvetlenül befolyásolja-e a működését. Emellett az Asc mennyisége és a bioszintézisének szabályozása jelentősen eltér a növényekben és a zöldalgákban, ezért adódott a kérdés, hogy az Asc milyen szerepet tölt be az algák NPQ folyamataiban. E kérdés megválaszolására egy inszerciós VTC2 mutánst azonosítottunk és jellemeztünk a fotoprotektív folyamatokat illetően.

Eredmények

Az Asc NPQ-ban betöltött szerepének vizsgálatához szükség volt egy stabil, igen alacsony Asc-tartalmú C. reinhardtii mutánsra. Az IV. 4. fejezetben használt amiRNS technika hátránya, hogy csak géncsendesítésre alkalmas, stresszhatásokra a célgének expressziója megnőhet, emellett az amiRNS vonalak több generáció alatt csendesítődnek, amely sajnos megfigyelhető volt az általunk létrehozott VTC2-amiRNS vonalakon is (Vidal-Meireles és mtsai, 2017).

2016-ban publikálták a Chlamydomonas Library Project-et (CLiP), amely már kezdetben is sok ezer inszerciós mutánst tartalmazott (Li és mtsai, 2016b), és később VTC2 mutánsok is elérhetővé váltak. Ezek közül kettőt vizsgáltunk, amely a CLiP-ben elérhető adatok alapján ígéretesnek tűnt. Az egyikben a paromomicin rezisztenciát hordozó CIB1 kazetta a VTC2 gén közepén található (LMJ.RY0402.058624), míg a másikban a 3’UTR-ben, amely végülis nem bizonyult hatékonynak a VTC2 gén expressziójának, illetve az Asc tartalomnak a csökkentésében. Tehát a továbbiakban az előbbi mutánssal dolgoztunk, amelyet Crvt2-1-nek neveztünk el. A CIB1 kazetta pontos integrációs helyét PCR-rel és szekvenálással határoztuk meg (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2020).

Normál fényintenzitáson (kb. 100 µmol foton m^-2s^-1) a Crvtc2-1 mutáns kb. 10%-nyi Asc-ot tartalmazAsc-ott a CC-4533 vad típushoz képest, amely változatlan maradt H2O2 kezelés hatására is. Ellentétben a korábban általunk előállított VTC2-amiRNS vonalakkal (Vidal-Meireles és mtsai, 2017), a Crvtc2-1 mutánsban a VTC2 transzkript nem volt detektálható. A Crvtc2-1 mutáns növekedési üteme és a fotoszintetikus apparátus összetétele nagyon hasonló volt a vad típuséhoz közepes fényintenzitáson, azonban erős fényben és mixotróf körülmények között nem volt képes a túlélésre (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2020,).

Annak megerősítése érdekében, hogy az Asc-tartalom csökkenése valóban a VTC2 funkcionális inaktiválásához köthető, komplementációs vonalakat állítottunk elő.

Várakozásainknak megfelelően a komplementált vonalak Asc tartalma a vad típuséhoz hasonló volt (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2020).

Mixotróf módon, közepes fényintenzitáson (100 µmol foton m^-2s^-1) nevelt algakultúrák esetében intenzív megvilágítás alatt (530 µmol foton m^-2s^-1) az NPQ értéke jelentősen magasabb volt a Crvtc2-1 mutánsban, mint a kontroll törzsben (15. ábra). A mérés során jelentős violaxantin-deepoxidáció következett be, amely az NPQ qZ komponensének felel meg (Allorent és mtsai, 2013). A deepoxidáció nem különbözött a kontroll törzs és a Crvtc2-1 mutáns között, tehát az Asc-hiány nem befolyásolta a CrCVDE enzim aktivitását (15. ábra). Az NPQ meghatározása után mért FV/FM érték lecsökkent, amely arra utal, hogy az 530 µmol foton m^-2s^-1 fényintenzitáson 30 percig tartó megvilágítás alatt mérsékelt fotoinhibíció következett be (Adams és mtsai, 2013; Tikkanen és mtsai, 2014), amely kissé erőteljesebb volt a Crvtc2-1 mutánsban, mint a vad típusban (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2020).

15. ábra. NPQ (A) és a deepoxidációs index (B) változása magas fényintenzitáshoz (530 µmól foton m^-2s^-1) történő akklimatizáció során vad típusú (CC-4533) és Asc-hiányos (Crvtc2-1) mutáns C. reinhardtii zöldalgában. Mintavételi pontok: Nevelőfényen (1; 100 µmól foton m^-2s^-1), 30 perc sötétadaptáció után (2), 30 perces megvilágítás után (3; 530 µmól foton m^-2s^-1), 15 perc sötétben történő helyreállás után (4) (Vidal-Meireles és mtsai, 2020).

Megfigyeltük, hogy H2O2 hozzáadásával az NPQ értéke jelentősen megnőtt a vad típusban, valamint kataláz hatására lecsökkent a Crvtc2-1 vonalban, a de-epoxidációs index pedig változatlan maradt (16. ábra). Ez az eredmény arra enged következtetni, hogy az Asc-hiány hatására oxidatív stressz lép fel, amely az NPQ, azon belül is a fotoinhibíciós NPQ (qI) növekedéséhez vezetett.

Fotoautotróf módon nevelt kultúrák esetében az energia (ΔpH)-függő NPQ érték (qE, Peers és mtsai, 2009; Chaux és mtsai, 2017) megemelkedett, hasonló mértékben a vad típusú és a Crvtc2-1 mutánsban, amely azt bizonyítja, hogy az Asc zöldalgákban nem szükséges az

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

NPQ

Idő(perc) A

CC-4533 Crvtc2-1 530 µE

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

CC-5325 VTC2-CDS6

De-epoxidációsindex

CC-4533 Crvtc2-1 B

Nevelőfényen (1) Sötétadaptált (2)

Fényadaptált (3) Helyreállás után (4)

# #

1 2 3 4

energiafüggő-kioltás kialakulásához sem. Emellett megfigyelhető volt a fotoinhibícióval kapcsolatos qI komponens intenzitásának az emelkedése fotoautotróf módon nevelt kultúrák esetében is (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2020).

16. ábra NPQ (A, B, D, E) és a deepoxidációs index (C) változása magas fényintenzitáshoz (530 µmól foton m^-2s^-1) történő akklimatizáció során vad típusú (CC-4533) és Asc-hiányos (Crvtc2-1) mutáns C.

reinhardtii zöldalgában 1,5 mM H2O2 (A-C) és 5 µg/ml kataláz (D-E) jelenlétében és hiányában.

Mintavételi pontok: Nevelőfényen (1; 100 µmól foton m^-2s^-1), 30 perc sötétadaptáció után (2), Megvilágítás, majd 15 perc sötétben történő helyreállás után (3) (Vidal-Meireles és mtsai, 2020).

Összefoglalás

Az Asc fotoprotekcióban betöltött szerepeit illetően igen jelentős eltéréseket fedeztünk fel a magasabb rendű növények és a zöldalgák között. Növényekben az Asc elengedhetetlen a VDE aktivitásához, amelynek következtében Asc-hiány esetén alacsonyabb qE és qZ komponensek figyelhetők meg. Normál nevelési körülmények között az Asc-tartalom mintegy 80%-os csökkenése azonban nem okoz oxidatív stresszt és a qI komponens sem hangsúlyosabb a vad típushoz képest (Müller-Moulé és mtsai, 2003, 2004).

Felfedeztük, hogy C. reinhardtii-ban az Asc nem befolyásolja a violaxantin deepoxidációját, ennek megfelelően a qZ komponens sem mutat különbséget a vad típus és az Asc-deficiens mutáns között. Zöldalgákban a qE nem kapcsolódik közvetlenül a CVDE aktivitásához (Li és mtsai, 2016a), és eredményeink alapján kijelenthető, hogy az Asc nem befolyásolja e fotoprotektív mechanizmust sem. Másrészt felfedeztük, hogy a zöldalgák

0.0

esetében az Asc legfontosabb szerepe a szabadgyökök által indukált fotoinhibíciós kioltási mechanizmus (qI) mérséklése.

A fejezet alapjául az alábbi, levelező szerzős közlemény szolgált:

Vidal-Meireles A, Tóth D, Kovács L, Neupert J, Tóth SZ (2020) Ascorbate deficiency does not limit nonphotochemical quenching in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol 182: 597-611.