Az aszkorbát hosszan tartó sötétségben inaktiválja a vízbontó komplexet

Bevezetés: Szeneszcencia a növényekben

A levelek öregedése egy kontrollált, aktív folyamat, amely transzkripciós és metabolikus szabályozás révén lehetővé teszi a tartaléktápanyagok lebontását, szállítását és újrahasznosítását a magvakban és más növényi szervekben (Maillard és mtsai, 2015; Liebsch és Keech, 2016). Lefolyása és mértéke függ a növények korától, bár számos környezeti tényező is befolyásolja, mint például a fényintenzitás, a vízellátottság és a kórokozók jelenléte (Jing és mtsai, 2009; Sade és mtsai, 2018). Az öregedés vizsgálatára gyakran alkalmazott kísérleti modellrendszer a növények több napig tartó sötétkezelése (Buchanan-Wollaston és mtsai, 2005), amellyel a szeneszcencia folyamatai szinkronizálhatók és egyszerűsíthetők. Hosszan tartó sötétségben az átmeneti keményítőtartalékok viszonylag gyorsan kimerülnek (Smith és Stitt 2007). A következő fázisban a lipidek és aminosavak felhasználása teszi lehetővé az anyagcsere fenntartását a sötétségben (Usadel és mtsai, 2008; Kunz és mtsai, 2009; Fan és mtsai, 2017). A sötétség hatására bekövetkező szeneszcencia kezdeti lépései között szerepel a hormonszint, a cukortartalom, és a redox homeosztázis változása, valamint szabadgyökök által indukált stresszhatás (Jing és mtsai, 2008; Zentgraf és Hemleben, 2008; Rosenwasser és mtsai, 2011).

A hosszan tartó sötétségben bekövetkező élettani változások egyike a fotoszintetikus aktivitás csökkenése, amelyet az FV/FM és a fotokémiai kioltási (qP) paraméterek csökkenése jelez, amely az OEC inaktiválódásának tulajdonítható (pl. Sobieszczuk-Nowicka és mtsai, 2018).

Később megkezdődik a fotoszintetikus komplexek - a PSII, a PSI, a cytb6f és az ATP szintáz - degradációja (Yamazaki és mtsai, 2000, Kunz és mtsai, 2009, Barros és mtsai, 2017). A kloroplasztisz szerkezetével kapcsolatban azt figyelték meg, hogy a tilakoid membránok néhány napos sötétség után megduzzadnak, megnő a plasztoglobulusok száma, majd a kloroplasztiszok szétesnek (Sobieszczuk-Nowicka és mtsai, 2018; Niu és Guo, 2012), ezt követően pedig a klorofill lebomlása figyelhető meg. A sötét-indukált szeneszcencia folyamatában az autofágia igen jelentős szerepet játszik (Barros és mtsai, 2017; Avin-Wittenberg és mtsai, 2018; Elander és mtsai, 2018; Fan és mtsai, 2019).

Az alábbiakban vad típusú (Col-0), Asc-hiányos (vtc2-4), psbo1, kettős psbo1 vtc2 és psbr1 mutáns A. thaliana mutánsok segítségével tanulmányoztuk a vízbontó komplex hosszan tartó sötétség történő inaktiválódását.

Eredmények

Korábbi in vitro kísérletekben kimutatták, hogy amennyiben az OEC külső fehérjéit kémiai kezelésekkel eltávolítják, az Asc redukálhatja a vízbontó komplexet (Tamura és mtsai, 1990). Arról azonban nem állt rendelkezésre információ, hogy az Asc in vivo is képes-e inaktiválni az OEC-t. E kérdés vizsgálatához Asc-deficiens A. thaliana mutánst használtunk, a

vtc2-4-et, amelyet korábban részletesen jellemeztek, és megállapították, hogy normál körülmények között a növekedése és fotoszintetikus hatékonysága megegyezik a Col-0 vad típuséval (Lim és mtsai, 2016). Emellett a kísérletekbe bevontunk egy psbo1, valamint egy psbr mutánst, amelyek háttere szintén a Col-0, és korábban mind molekuláris biológiai, mind pedig élettani szempontból részletesen jellemezték őket. A psbo1 mutáns esetében jelentősen csökkent OEC aktivitást és ezért lassabb növekedést figyeltek meg (Lundin és mtsai, 2007;

Allahverdiyeva és mtsai, 2009), míg a psbr mutáns hasonlóan viselkedik, mint a vad típus, leszámítva a valamivel lassabb QA-QB közötti elektrontranszportot (Liu és mtsai, 2009, Allahverdiyeva és mtsai, 2013).

10. ábra A hosszan tartó sötétség hatása vad típusú (Col-0) A. thaliana növények, valamint Asc-hiányos vtc2-4, valamint psbr és psbo1 mutánsok klorofill-a fluoreszcencia (OJIP) tranzienseire. (A) A Col-0 és a mutáns növények OJIP tranziensei normál növekedési körülmények között. (B) A Col-0 és a mutáns növények OJIP tranziensei 24 órás sötétkezelés után. (C) A Col-0, vtc2-4, psbr és psbo1 mutánsok változó fluoreszcencia (FV) értékei normál növekedési fényviszonyok között vagy 24 órás sötétkezelést követően.

(D) A maximális fluoreszcencia-intenzitás eléréséhez szükséges idő (TFM érték, ms-ban).

A hosszan tartó sötétség a fotoszintetikus elektrontranszportra gyakorolt hatását klorofill-a fluoreszcencia segítségével vizsgáltuk. Négy napos sötétkezelés alatt az FV/FM érték igen jelentős mértékben, kb. 0.4-re csökkent (Függelék: Podmaniczki és mtsai, 2021). Az FM (P) érték csökkenése mellett már egy napos sötétkezelés után megfigyelhető a K lépés megjelenése, amely a vízbontó komplex inaktivációját jelzi (Srivastava és mtsai, 1997; Tóth és

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

0.01 1 100 10000 0

500 1000 1500 2000 2500 3000

0.01 1 100 10000

0 500 1000 1500 2000

Fény Sötét

0 1000 2000 3000

Fény Sötét

Kl-afluoreszcencia (r.e.)

Kl-afluoreszcencia (r.e.)

Idő (ms) Idő (ms)

Fény Sötét

FV

Col-0 vtc2-4 psbr psbo1 Col-0 vtc2-4 psbr psbo1

Col -0 vtc2-4 psbo1 psbr

Col -0 vtc2-4 psbo1 psbr A

C D

B

TFM(ms)

mtsai, 2009). Célunk a kezdeti inaktivációs lépések vizsgálata volt, ezért 24 órás sötétkezelést alkalmaztunk a továbbiakban.

Megfigyeltük, hogy a K lépés jóval kevésbé jelenik meg hangsúlyosan a vtc2-4 mutánsban a sötétkezelés hatására, az FV érték kevésbé csökken, valamint az FM érték eléréséhez szükséges idő (TFM) rövidebb, mint a vad típus esetében (10. ábra). A psbo1 mutáns ezzel szemben igen érzékeny volt a sötétkezelésre, a fluoreszcencia kinetikájában nagyon erősen megjelent a K lépés, valamint az elektrontranszport valamelyest tovább lassult a fényben tartott kontrollhoz képest. A psbr mutáns J lépése viszonylag magas, ami a korábban leírt QA-QB elektrontranszport lassulásnak köszönhető (Liu és mtsai, 2009, Allahverdiyeva és mtsai, 2013), sötétben pedig a vad típushoz hasonló mértékű változások következtek be (10.

ábra).

11. ábra 24 órás sötétkezelés hatása a vad típusú Col-0, az Asc-hiányos vtc2-4, valamint a psbr és a psbo1 mutánsok A. thaliana növények TL görbéire. (A) Normál fényviszonyok között nevelt (F) és 24 órán keresztül sötétben tartott (S) vad típusú és a mutáns növények levélszegmensein mért TL görbék (L). (B) A vad típusú és a mutáns növények B sávjának maximális intenzitása.

A vízbontó komplex sötétben történő inaktivációját alátámasztandó, termolumineszcencia méréseket végeztünk. A B sáv (S2S3-QB- rekombináció, Ducruet és Vass, 2009) intenzitása kb. 75%-kal csökkent a vad típusban a sötétkezelés hatására, míg a csökkenés mértéke jóval kisebb, mintegy 50%-os volt az Asc-deficiens mutánsban (11. ábra). A psbr mutánsban a csökkenés még erőteljesebb volt, mint a vad típusban, valamint hasonlóan alacsony volt a B sáv intenzitása a psbo1 mutánsban is (11. ábra). Eredményeink tehát bizonyítják, hogy a 24 órás sötétkezelés hatására a vízbontó aktivitás jelentősen lecsökken, amely viszont jóval mérsékeltebb alacsony Asc koncentráció mellett. Ez összhangban van a

0 200 400 600 800 1000

0 20 40 60 80

Hőmérséklet(°C)

Termolumineszcencia (r.e.)

0 500

1000 Fény

Sötét

Rel. B-sáv intenzitás

A

B

Col-0 vtc2-4 psbr psbo1

Col-0 F Col-0 S vtc2-4 F vtc2-4 S psbr F psbr S psbo1 S psbo1 F B-sáv

korábbi in vitro eredményekkel, mely szerint az Asc redukálhatja a Mn-klasztert (Tamura és mtsai, 1990).

Bizonyos másodlagos hatásokat kizárandó, megbizonyosodtunk róla, hogy a 24 órás sötétkezelés alatt nem csökkent a levelek klorofilltartalma, az Asc-tartalma, a különböző fotoszintetikus alegységek (beleértve az OEC külső fehérjéit) sem degradálódtak, valamint a kloroplasztiszok szerkezete is ép maradt (Függelék: Podmaniczki és mtsai, 2021).

Annak vizsgálatára, hogy az Asc nemcsak sötétben, haem a PSBO hiányában normál körülmények között is képes redukálni a Mn-klasztert, kereszteztük a psbo1 és a vtc2-4 mutánst. A dupla homozigóta vonalak azonosítása sikeres volt, valamint a dupla homozigóták fenotípusa hasonló a psbo1 mutánséhoz (Függelék: Podmaniczki és mtsai, 2021). A gyors klorofill-a fluoreszcencia indukció vizsgálatakor viszont felfedeztük, hogy a dupla psbo1 vtc2 mutáns fotoszintetikus fenotípusa enyhébb a szimpla psbo1 mutánshoz képest: az FM érték magasabb, valamint az FM eléréséhez szükséges idő jelentősen rövidebb (Függelék:

Podmaniczki és mtsai, 2021).

Összefoglalás

Eredményeink alapján kijelenthető, hogy az Asc képes inaktiválni a vízbontó komplexet, és ennek megakadályozásában az OEC külső fehérjéinek fontos szerepe van, elsősorban a PSBO-nak. Feltételezhető, hogy sötétkezelés hatására az OEC külső fehérjék kötődése fellazul, vagy akár disszociálódnak is a PSII-ről, amely lehetővé teszi az Asc hozzáférését a Mn-klaszterhez, ezáltal annak redukcióját.

Eredményeink rávilágítanak arra, hogy az Asc negatívan befolyásolhat bizonyos élettani folyamatokat, ezért állhat annak koncentrációja és lokalizációja erős szabályozás alatt a növényi sejtben, amelyet feltétlenül figyelembe kell venni akkor, ha magas Asc-tartalmú növényfajták előállítását tűzzük ki célul.

A fejezet alapjául az alábbi, levelező szerzős közlemény szolgált:

Podmaniczki A, Nagy V, Vidal-Meireles A, Tóth D, Patai R, Kovács L, Tóth SZ (2021) Ascorbate inactivates the oxygen-evolving complex in prolonged darkness. Physiol Plantarum 171: 232-245.