IV. E REDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
IV. 6. Az aszkorbát hatása a zöldalgák hidrogéntermelésére
Bevezetés: A Chlamydomonas reinhardtii fotoszintetikus hidrogéntermelése
A zöldalgák a fotoszintézisükhöz kapcsoltan, hipoxiás környezetben a sötét-fény átmenet során H2-t termelnek a PSI akceptor oldalán található [Fe-Fe]-típusú HydA hidrogenáz enzimük segítségével (17. ábra). A folyamat élettani szerepe abban rejlik, hogy a Calvin-Benson ciklus fényben történő aktiválódásáig a H2-termelés mintegy biztonsági szelepként védi a fotoszintetikus elektrontranszportot a túlzott gerjesztéstől (Godaux és mtsai, 2016).
17. ábra. A zöldalgák fotoszintetikus elektrontranszportlánca és H2-termelése. Aerob körülmények között az elektrontranszportlánc működése a magasabb rendű növényekéhez hasonló (ld. 5. ábra).
Hipoxiás körülmények között hidrogenázok (HydA) fejeződnek ki és a vízbontásból, valamint esetlegesen a keményítőbontásból származó elektronok H2-termelésre fordítódnak a Calvin-Benson ciklus aktiválódásáig. Rövidítések: cytb6f: citokróm b6f komplex; Fd: ferredoxin; LHC: klorofill a/b fénybegyűjtő pigment-protein komplexek; NDH: NAD(P)H dehidrogenáz enzim; PC: plasztocianin; PQ: plasztokinon, PSI: I. fotokémiai rendszer; PSII: II. fotokémiai rendszer; P680: a PSII elsődleges elektrondonora; P700: a PSI elsődleges elektrondonora; QA: a PSII elsődleges kinon akceptora. A pgrl1 és a pgr5 részt vesznek a PSI ciklikus elektrontranszportban vesz részt, amely, csakúgy, mint a flavo-diiron (FLV) komplexek, a HydA-val versengenek az elektronokért (Tóth és Yacoby, 2019).
A C. reinhardtii hidrogenáza a működéséhez szükséges elektronokat közvetlenül a Fd-tól kapja (17. ábra; Happe és Naber, 1993; Happe és mtsai, 1994). Az elektronok három útvonalon érkezhetnek: 1) függő útvonalon, ahol az elektronok a vízbontásból származnak és a PSII-cytb6f-PSI-en át vezető lineáris elektrontranszporton keresztül jutnak el a hidrogenázhoz (Ghirardi és mtsai., 2000); 2) PSII-független útvonalon, amelyben az elektronok a keményítő lebontásából származnak és a PQ-pool-on keresztül csatlakoznak a lineáris elektrontranszporthoz (Gfeller és Gibbs, 1984); 3) fermentációs útvonalon, ahol a glikolízisben
LHC PSII PQ-pool PSI LHC
Calvin-Benson ciklus
HydA FNR
CO2
NADP+
NADPH ADP+Pi ATP
NADP+
H+ NDH Fd
H2
2H+ Kloroplasztisz sztróma
e -QA
e -e
-e
-cytb6f e
-H+ PC
P700 P680
OEC e- e
-2 H2O O2 + 4H+
Tilakoid lumen O2+4H+
2 H2O
e
-H+ H+
H+
H+ PMF = ΔpH + Δψ
+ + +
+ +
+ +
+ +
+
- - - -
- -
- -
- - - -
-
e
--
keletkező piruvát a piruvát-oxidoreduktáz (PFX) segítségével acetil-Ko-A-vá alakul, miközben a Fd redukálódik, ahonnan az elektronok a hidrogenáz enzimre kerülnek (Noth és mtsai, 2012).
A H2-termelés elméleti fénykonverziós hatékonysága mintegy 13% (Torzillo és mtsai, 2015), amely legalább egy nagyságrenddel meghaladja a biomassza alapú megújuló erőforrásokét. A természetben a H2-termelés azonban csak pár percig tart, amely a hidrogenázok O2-érzékenységének, valamint a kompetitív folyamatok működésének köszönhető (Tóth és Yacoby, 2019). A H2-termelés folyamatát régóta próbálják hatékonyabbá és folyamatossá tenni, annak érdekében, hogy teljes mértékben megújuló és tiszta energiaforráshoz jussunk. Megfigyelték, hogy az algakultúrákat kénmegvonásnak teszik ki, a H2-termelés folyamata napokig tart (Melis és mtsai, 2000; Kosourov és Seibert, 2009; Saroussi és mtsai, 2017).
A kén esszenciális elem minden élőlény számára, amely megtalálható a fehérjékben, lipidekben, számos anyagcseretermékben, jeltávivő és elektrontranszport-komponensben. A kénmegvonás hatására a kén (szulfát) felvételért felelős transzporterek génexpressziója megemelkedik, a szulfát asszimilációja fokozódik és a sejten belüli tartalékok mozgósításra kerülnek (Pootakham és mtsai, 2010). A kénmegvonás a sejtnövekedés és osztódás megszűnéséhez, és a sejtfal szerkezetének megváltozásához vezet (Takahashi és mtsai, 2001).
Emellett a normál ellipszis alakú sejtekből már a kénmegvonás korai szakaszában szélesebb és gömbölyűbb sejtek alakulnak ki, majd a kénmegvonás és H2-termelés előrehaladtával a sejttömeg csökkenni kezd (Zhang és mtsai, 2002). Ezen kívül a kénmegvonás hatására leáll a klorofill-bioszintézis, erős keményítő- és foszfatidil-glicerin-felhalmozódás, valamint szulfolipid-lebontás következik be (Sugimoto és mtsai, 2007; Sugimoto és mtsai, 2008).
Jellegzetes hatás a PSII, PSI és ATP szintáz alegységeket kódoló gének kifejeződésének a csökkenése, míg két specifikus antennafehérje, az LHCBM9 és az LHCSR1 transzkripciós szintje megemelkedik (Nguyen és mtsai, 2011; Toepel és mtsai, 2013). A fotoszintetikus aktivitás csökkenése a Rubisco és a különféle fotoszintetikus komplexek lebomlásának köszönhető (Zhang és mtsai, 2002). Másrészt a légzés fennmarad, amely a PSII-aktivitás csökkenésével együtt hipoxia kialakulását eredményezi, lehetővé téve az O2-érzékeny HydA kifejeződését (Zhang és mtsai, 2002; Volgusheva és mtsai, 2013). A H2-termeléshez szükséges elektronok többnyire a fennmaradó PSII-aktivitásból származnak, de a keményítő lebomlása isjelentősen hozzájárulhat a H2-termeléshez, nemcsak reduktánsok biztosításával, hanem a hipoxia kialakulásának elősegítésével is (Chochois és mtsai, 2009). A H2-termelési periódus általában 4-6 napig tart, majd ezt követően apoptotikus sejthalál következik be (Toepel és mtsai, 2013).
A PSII-aktivitás csökkentése elengedhetetlen lépés a H2-termelés megindulásához. Az általános vélekedés szerint a PSII-aktivitás elvesztése a PsbA fehérje kénhiány által gátolt turnoverének tudható be (Zhang és mtsai, 2002; Volgusheva és mtsai, 2013; Antal és mtsai, 2015), mivel ennek a fehérjének a leggyorsabb a turnovere az összes fotoszintetikus komplex között (Nelson és mtsai, 2014). Irodalmi adatok azonban azt valószínűsítik, hogy a PSII-aktivitás
csökkenése szabályozott folyamat, ugyanis bizonyos mutánsok (sac1 és snrk2.1) nem képesek kénmegvonás alatt csökkenteni fotoszintetikus aktivitásukat, és ezért hamarabb pusztulnak el, mint a vad típus (Davies és mtsai, 1996; González-Ballester és mtsai, 2008). Emellett azt is kimutatták, hogy a PSII-aktivitás csökkenésében a szabadgyökök jelentős szerepet játszanak (González-Ballester és mtsai, 2010). Mindezek alapján valószínűsíthető, hogy a PsbA fehérje intenzív turnovere nem magyarázza a PSII leépülését a kénmegvonás során, ezért célul tűztük ki e folyamat alaposabb megismerését.
Eredmények
A kénmegvonás hatásainak és a H2-termelés folyamatának tanulmányozásához az egyik leggyakrabban használt törzset, a CC-124-et használtuk. Az algasejteket kénmentes acetát-tartalmú tápoldatban mostuk, a kultúrák klorofilltartalmát 20 µg klorofill (a+b)/ml-re állítottuk be, N2-gázzal átfúvattuk őket, majd lezárt állapotban 100 µmól foton m-2s-1 megvilágításnak tettük ki 96 órára. 48 óra után már jelentős mennyiségű H2-t detektáltunk, és az O2
koncentrációja igen alacsony volt (18.A ábra), ami összhangban van az irodalmi adatokkal. A sejtek kénmentes közegbe történő áthelyezése után a klorofilltartalom 96 órán keresztül állandó volt, a sejtszám körülbelül 25%-kal megemelkedett, míg a sejtek térfogata kétszeresére nőtt. Az első 24 órában jelentős keményítőfelhalmozódás következett be, amely a következő napokban lebomlott (Függelék: Nagy és mtsai, 2016; Nagy és mtsai, 2018), összhangban az irodalmi adatokkal (pl. Zhang és mtsai, 2002).
Ezt követően ICP-OES segítségével (Szentmihályi és mtsai, 2015) vizsgáltuk a sejtek elemi összetételét. 48 órával a sejtek kénmentes TAP tápoldatba történő áthelyezése után a sejtszámra vonatkoztatott kéntartalom mérsékelten, mindössze kb. 25% -kal csökkent (Függelék: Nagy és mtsai, 2018). A kénmegvonás hatására a PsbA mennyisége folyamatosan csökkent (18.B ábra). Hasonló ütemben csökkent a PSBO mennyisége is, viszont a PSII egyik belső antennájaként szereplő fehérje, a CP43, valamint a Rubisco igen gyorsan degradálódott, míg a cytb6f egyik alegysége, a PetB és a PSII egyik fő alegysége, a PsaA stabil maradt (18. ábra).
Linkomicin (LM) alkalmazásával, amely gátolja a kloroplasztiszban kódolt fehérjék bioszintézisét, a fehérjeturnover mértéke vizsgálható. Jelenlétében a PsbA mennyisége gyorsabban csökkent, míg a többi fotoszintetikus alegység (RbcL, PetB, CP43 and PsaA) degradációs rátája alig változott (Függelék: Nagy és mtsai, 2018). Az FV/FM fotoszintetikus paraméter is gyorsabban csökkent az LM-mel kezelt mintákban (18. ábra).
Eredményeink alapján kijelenthető, hogy a PsbA turnoverét a kénmegvonás mérsékelten gátolta több más fotoszintetikus alegységéhez képest. Számításba véve azt is, hogy a sejten belüli kéntartalom mindössze 25%-kal csökkent (Függelék: Nagy és mtsai, 2018), kijelenthető, hogy a korábbi feltételezésekkel ellentétben (Melis és mtsai, 2000; Zhang és mtsai, 2002, Volgusheva és mtsai, 2013; Antal és mtsai, 2015) a PSII inaktiválódását nem a PsbA turnoverének kénhiány általi gátlása okozza.
Megfigyeltük, hogy a kénmegvonás hatására a VTC2 expressziója megemelkedik, ennek következtében pedig az Asc-tartalom 48 órán belül kb. 50-szeresére nő (19. ábra). Kimutattuk, hogy számos, 1O2 által indukált gén expressziója megnő a kénmegvonás során, tehát nagy valószínűséggel oxidatív stressz történik a kénmegvonás során, ami az Asc-bioszintézis indukciójához vezet (Függelék: Nagy és mtsai, 2018).
18. ábra. C. reinhardtii (CC-124) H2-termelése (A), egyes fotoszintetikus komplexek mennyiségének (B-G), valamint az FV/FM érték változása ( H) 96 órás kénmegvonás során (Nagy és mtsai, 2018).
Magasabb rendű növényekben az Asc bizonyos körülmények között inaktiválhatja az OEC-t (IV. 3. fejezet). C. reinhardtii-ban néhány mM-nyi külsőleg hozzáadott Asc hatására a B TL sáv intenzitása erőteljesen csökken, illetve folyamatosan csökken a kénmegvonás során is (19.C ábra), tehát a zöldalgák Mn-komplexe különösen érzékeny az Asc redukáló hatására. Az OEC inaktivációját követően az Asc elektronokat szolgáltat a TyrZ+ számára, amely folyamat igen lassú a vízbontásból származó elektrontranszporthoz képest (félidők: kb. 20-50 ms, illetve 0,1-1 ms; Tóth és mtsai, 2009). Ennek következtében P680+, TyrZ+, szuperoxid és hidroxilgyökök (Chen és mtsai, 1995; Spetea és mtsai, 1997) halmozódnak fel, majd donor oldal által indukált fotoinhibíció léphet fel, csakúgy, mint magasabb rendű növények esetében (IV. 2. fejezet).
19. ábra. A VTC2 gén expressziós szintjének (A), az Asc-tartalom és B TL sáv intenzitásának a változása C.
reinhardtii-ban kénmegvonás során (Függelék: Nagy és mtsai, 2018).
A donor-oldani fotoinhibíció kialakulásának bizonyítására fotoszintetikus elektrontranszport-aktivitást mértünk, izolált tilakoid membránokon MV jelenlétében. A MV terminális PSI akceptorként működik, az elektronokat O2-molekulákra továbbítja, ezáltal O2 -fogyasztásként mérhető az elektrontranszport sebessége. A DPC alternatív PSII elektrondonor, anélkül, hogy befolyásolná az OEC aktivitását (IV. 2. fejezet). Az elektrontranszport aktivitása folyamatosan csökkent a kénmegvonás során (20.A ábra), egyezésben a TL eredményekkel (19.
ábra). DPC jelenlétében kb. 30-100%-kal magasabb elektrontranszport rátát mértünk (20.B ábra), bizonyítva, hogy jelentős mennyiségű PSII van jelen, amelyek donor oldala inaktív, de a reakciócentumok stabil töltésszeparációra képesek.
20. ábra. C. reinhardtii kultúrák MV-függő O2-felvétele kénmegvonás során, a DPC, mint mesterséges PSII elektrondonor jelenlétében és hiányában. A) O2-felvételi ráta a kénmegvonás időtartamának függvényében. B) Az O2-felvételi ráta aránya DPC jelenlétében és hiányában (Nagy és mtsai, 2018).
Asc tartalom (mM)
0 1 2 3
0 24 48 72 96
0 2 4 6 8
0 24 48 72 96
Idő (óra)
Rel. VTC2 transzkript
A B
Idő (óra)
0 1000 2000 3000
0 10 20 30 40 50 60 70 Kontroll -S 0 h -S 24 h -S 48 h -S 72 h -S 96 h
C
Rel. TL intenzitás
Hőmérséklet (°C) B-sáv
(DPC-Kontroll)/Kontroll (%)
0 8 16 24 32
0 24 48 72 96
-S -S +DPC
Idő (óra)
0 40 80 120 160
0 12 24 36 48 60 72 96
A B
Idő (óra) mmól O2mg Kl-1h-1
Összefoglalás
Kénmegvonás hatására a következő folyamatok játszódnak le a zöldalgákban i) az algasejtek fokozzák a kén felvételét a környezetből, ii) minimalizálják a sejtek kéntartalmának csökkenését a sejtosztódás leállításával, iii) mivel a sejtosztódás leáll, feleslegben lévő reduktánsok halmozódnak fel, amelyek kezdetben keményítő-bioszintézisre fordítódnak, iv) a PSII túlzott gerjesztése miatt 1O2 képződik, amely az Asc-bioszintézis fokozódásához vezet, v) A mM koncentráció-tartományban felhalmozódott Asc inaktiválja az OEC-t, vi) ezért a PSII reakciócentrumok donor oldali fotoinhibíció által károsodnak és lebomlanak, vii) az O2 -termelés csökkenése hozzájárul a hipoxia kialakulásához, amely lehetővé teszi a HydA kifejeződését és a H2 termelés megindulását, amely a fotoszintetikus elektrontranszport biztonsági szelepeként működik.
E lépéseknek köszönhetően a kénmegvonás által okozott károsodás mérséklődik, és a sejtek helyreállhatnak, amennyiben a kén újra elérhetővé válik. Eredményeink cáfolják tehát azt a korábbi vélekedést, mely szerint a PsbA lenne a kénmegvonás elsődleges célpontja.
A fejezet alapjául az alábbi közlemények szolgáltak:
Nagy V, Tengölics R, Schansker G, Rákhely G, Kovács K, Garab G, Tóth SZ (2012) Stimulatory effect of ascorbate, the alternative electron donor of photosystem II, on the hydrogen production of sulphur-deprived Chlamydomonas reinhardtii. Int J Hydrogen Energy 37: 8864-8871
Nagy V, Vidal-Meireles A, Tengölics R, Rákhely G, Garab G, Kovács L, Tóth SZ (2016) Ascorbate accumulation during sulphur deprivation and its effects on photosystem II activity and H2 production of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell Environ 39: 1460-1472
Nagy V, Vidal-Meireles A, Podmaniczki A, Szentmihályi K, Rákhely G, Zsigmond L, Kovács L, Tóth SZ (2018) The mechanism of photosystem II inactivation during sulphur deprivation-induced H2 production in Chlamydomonas reinhardtii. Plant J 94: 548-561
Tóth SZ, Yacoby I (2019) Paradigm shift in algal H2 production: Bypassing competitive processes. Trends Biotechnol 37: 1159-1163