IV. E REDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
IV. 4. Az aszkorbát bioszintézisének szabályozása zöldalgákban
Bevezetés: A zöldalgák aszkorbát-tartalma rendkívül alacsony
Magasabb rendű növényekben az Asc az ún. Smirnoff-Wheeler útvonalon képződik (Wheeler és mtsai, 1998; 3. ábra), és az Asc-bioszintézis szabályozásában az egyik legfontosabb gén a GDP-L-galaktóz foszforilázt kódoló VTC2. A VTC2 gén expresszióját jelentősen befolyásolja a fotoszintetikus aktivitás, a cirkadián óra és a fényintenzitás (Dowdle és mtsai, 2007). Zöldalgákban megtalálhatók a Smirnoff-Wheeler útvonal génjeinek homológjai (Urzica és mtsai, 2012b), azonban működésére kísérletes bizonyíték nem állt rendelkezésre, valamint a bioszintézis szabályozásának elemei sem voltak ismertek. Ez abból a szempontból érdekes, hogy a zöldalgák kb. századannyi Asc-ot tartalmaznak, mint a magasabb rendű növények (Gest és mtsai, 2013) ezért adódott a kérdés, hogy hogyan képesek megbirkózni a környezeti stresszhatásokkal ilyen alacsony Asc koncentráció mellett.
Eredmények
A zöldalgák Asc-bioszintézisének tanulmányozására mesterséges mikroRNS (amiRNS) technikával lecsökkentettük a VTC2 expresszióját C. reinhardtii-t használva modellszervezetként. Az általunk létrehozott VTC2-amiRNS vonalak VTC2 expressziója alacsony volt, ennek megfelelően az Asc tartalmuk mintegy tizede volt a kontrollként használt „üres vektor” (EV) törzsekének. Megvizsgáltuk a Smirnoff-Wheeler útvonal több más génjének is az expresszióját és legtöbbjük csökkent volt a VTC2-amiRNS vonalakban a kontroll vonalakhoz képest (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2017). H2O2 kezelés hatására a kontroll törzs Asc tartalma 8 órán belül a háromszorosára nőtt, a VTC2-amiRNS vonalak esetében pedig csak kis mértékben emelkedett meg (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2017).
A VTC2-amiRNS vonalak fokozott stresszérzékenységet mutattak, amely lassabb növekedésben, a klorofilltartalom és a fotoszintetikus elektrontranszport csökkenésében, valamint a prolin akkumulációjában nyilvánul meg (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2017).
Megvizsgáltuk a fotoszintézis és az Asc-bioszintézis kapcsolatát. DCMU hatására, amellyel a lineáris elektrontranszport teljes mértékben gátolható, a VTC2 expressziójának és ezáltal az Asc bioszintézisének fokozódása volt megfigyelhető, amely éles ellentétben áll a növényekben megfigyelt hatásokkal szemben, azokban ugyanis a DCMU kezelés gátolja az Asc bioszintézisét (Yabuta és mtsai, 2007).
Az Asc-bioszintézis Rose Bengal (RB) kezelés hatására (mely 1O2 képződését indukálja) is jelentősen megemelkedett, amely azt jelenti, hogy zöldalgákban –a növényekkel ellentétben- nemcsak a H2O2, hanem közvetlenül a 1O2 is fokozza az Asc termelődését, függetlenül a fotoszintetikus elektrontranszportlánc működésétől. Ezt alátámasztja az az eredményünk is, hogy sötétben tartott kultúrák Asc bioszintézise szintén fokozható volt H2O2 hozzáadásával (12.
ábra).
12. ábra. Rose Bengal (RB) és DCMU kezelés hatása Asc-deficiens (VTC2-A27) és kontroll (EV2) C.
reinhardtii törzsek Asc-tartalmára (A) és VTC2 transzkript szintjére (B).
Magasabb rendű növényekben az Asc-bioszintézis jelentősen függ a napszakok változásától (Dowdle és mtsai, 2007). C. reinhardtii-ban megvilágítás hatására az Asc menyisége mintegy ötszörösére növekedett két órán belül, majd sötétben az Asc mennyisége két órán belül a felére csökkent (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2017). Ennek oka lehet közvetlen fényszabályozás, illetve a megvilágítás hatására képződő H2O2 és 1O2 (Shao és mtsai, 2007). C. reinhardtii-ban folyamatos megvilágítás alatt periodicitás nem volt megfigyelhető az Asc bioszintézisében (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2017), tehát zöldalgákban az Asc-bioszintézis valószínűleg nem áll cirkadián szabályozás alatt.
13. ábra. Külsőleg hozzáadott Asc hatása az EV2 és a VTC2-A27 C. reinhardtii vonalakra. A) A sejten belüli Asc-tartalom 0,1, 0,5 vagy 2,0 mM Asc hozzáadását követő 4. órában B) A relatív VTC2 transzkript szint 0,1, 0,5 vagy 2,0 mM Asc hozzáadását követő 4. órában
0 2 4 6 8 10 12 14 16
ev2 vtc2-a27
Rel. VTC2transzkriptszint
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
0 60 120 180 240
A
B
VTC2-A27 EV2
Kontroll + DCMU + RB + DCMU + RB
0 600 1200 1800 2400 3000 3600
0 60 120 180 240
Asc-tartalom (µM)
Kontroll + DCMU + RB + DCMU + RB
EV2 VTC2-A27
Idő (perc) Idő (perc)
0 200 400 600 800 1000 1200
Asc-tartalom(µM)
A B
EV2 VTC2-A27
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
EV2 VTC2-A27
Kontroll + 0.1 mM Asc + 0.5 mM Asc + 2.0 mM Asc
Rel. VTC2transzkriptszint
Magasabb rendű növényekben az Asc negatív visszacsatolással szabályozza a VTC2 expresszióját és a GDP-L-galaktóz foszforiláz transzlációját (Laing és mtsai, 2015). Ezzel szemben megállapítottuk, hogy C. reinhardtii-ban élettanilag releváns mennyiségű Asc hozzáadásával a VTC2 expressziója jelentősen megnő és az Asc-bioszintézis fokozódik (13.
ábra), amely arra enged következtetni, hogy zöldalgákban az Asc bioszintézise pozitív visszacsatolás által is szabályozódik.
Összefoglalás
Standard környezeti körülmények között a zöldalgák valamint a mohák igen kis mennyiségű, kb. 100 µM-nyi koncentrációban tartalmaznak Asc-ot, míg a cianobaktériumok valószínűleg egyáltalán nem tartalmaznak Asc-ot (Gest és mtsai, 2013; Wheeler és mtsai, 2015).
Az evolúció során a szárazföldi életmódra való áttéréssel a növényeket egyre több stresszhatás érte, amelynek köszönhetően az Asc egyre nagyobb szerephez jutott a túlélésben (Foyer és Noctor 2011). Ennek következtében az Asc a növények egyik legnagyobb mennyiségben előforduló anyagcsere-termékévé vált, amelynek mennyisége stresszhatások alatt még további két-háromszorosára növekedhet (Müller-Moulé és mtsai, 2003; Müller-Moulé és mtsai, 2004).
14. ábra. Az Asc-bioszintézis lépései és szabályozása magasabb rendű növényekben és zöldalgákban.
Rövidítések: GMP: GDP-mannóz pirofoszforiláz; GME: GDP-mannóz-3’,5’-epimeráz; GGP: GDP-L-galaktóz foszforiláz; GPP: L-galaktóz-1-foszfát foszfatáz; GDH: L-galaktóz dehidrogenáz; GLDH: L-galaktono-lakton dehidrogenáz; csz: citoszol; kp: kloroplasztisz; m: mitokondrium; n: nukleusz; p: pirenoid; pm:
plazmamembrán; t: tilakoid; v: vakuólum (Tóth és mtsai, 2018).
A C. reinhardtii zöldalga édesvízben és talajban él, ezért élete során számos stresszhatásnak van kitéve, bár valószínűleg ritkábban, mint a szárazföldi növények. Mivel igen kevés Asc-ot tartalmaz, ezért megvizsgáltuk, hogyan szabályozzák az Asc bioszintézisüket, lehetővé téve a különböző stresszhatásokhoz történő akklimatizációt. Megállapítottuk, hogy
csz
n D-mannóz-1P
GDP-D-mannóz GDP-L-galaktóz L-galaktóz-1P
L-galaktóz L-galaktono-lakton
GMP GME GGP
GPP GDH
v kp
L-Asc GLDH pm
t
m
v csz D-mannóz-1P
GDP-D-mannóz GDP-L-galaktóz L-galaktóz-1P
L-galaktóz L-galaktono-lakton
kp H2O2
1O2
n
p
L-Asc t
GMP GME GGP
GPP GDH
GLDH
csakúgy, mint a magasabb rendű növényekben, az Asc a Smirnoff-Wheeler útvonalon képződik zöldalgákban is, azonban a bioszintézis élettani szabályozása jelentősen eltér, ami lehetővé teszi az Asc koncentrációjának rendkívül gyors és nagymértékű megemelkedését, amely elengedhetetlen a környezeti stresszadaptációhoz. A növényekkel ellentétben, zöldalgákban a szabadgyökök közvetlenül serkentik a VTC2 gén expresszióját, a fotoszintetikus elektrontranszport közvetlenül nem szükséges az Asc-bioszintézishez, a cirkadián óra nem szabályozza az Asc bioszintézisét, viszont – szokatlan módon - az Asc pozitív visszacsatolással fokozza a VTC2 gén expresszióját és az Asc bioszintézisét.
A fejezet alapjául az alábbi, levelező szerzős közlemények szolgáltak:
Vidal-Meireles A, Neupert J, Zsigmond L, Rosado-Souza L, Kovács L, Nagy V, Galambos A, Fernie AR, Bock R, Tóth SZ (2017) Regulation of ascorbate biosynthesis in green algae has evolved to enable rapid stress-induced response via the VTC2 gene encoding GDP-L-galactose phosphorylase. New Phytol 214: 668-681
Tóth SZ, Lőrincz T, Szarka A (2018) Concentration does matter: The beneficial and potentially harmful effects of ascorbate in humans and plants. Antioxid Redox Signal 29: 1516-1533 (összefoglaló cikk, címlapon történő megjelenéssel).