I. Á LTALÁNOS BEVEZETÉS
I. 1. A C-vitamin (aszkorbát) antioxidáns és más élettani szerepei
Az aszkorbát (Asc) az egyik legismertebb vitamin, ismertsége ellenére azonban még számos kérdés vár tisztázásra a bioszintézisét, degradációját és a sejtben betöltött szerepeit illetően. Az Asc az eukarióta szervezetek számára élettani szempontból nélkülözhetetlen, azonban érdekes módon egyes állatfajok és az ember szervezete nem képes termelni. Így, mi, emberek a növények által termelt Asc-ra vagyunk utalva.
Reaktív oxigénformák semlegesítése
Hidrofil jellege miatt az Asc vízben nagyon jól oldódik, kevésbé oldódik etanolban, és nem oldódik olajokban, zsírokban és zsíros oldószerekben. Egy elektron átadása egy redox partner számára monodehidroaszkorbát (MDA) gyök képződését eredményezi, amelyet aszkorbilcsoportnak is neveznek. A MDA diszmutációjával Asc és dehidro-aszkorbát (DHA) képződik (1. ábra; Smirnoff, 2018).
1. ábra. Az Asc redoxreakciói (zölddel jelölve) és lebomlása (pirossal jelölve); Smirnoff (2018) nyomán.
Növényekben az Asc legismertebb szerepe a fotoszintézis során a kloroplasztiszokban és a mitokondriumokban a légzés melléktermékeként képződött reaktív oxigénformák (ROS) felhalmozódásának megakadályozása (Foyer, 2018; Waszczak mtsai, 2018; Foyer és mtsai, 2020; 2. ábra). Az MDA-gyök gyenge reaktivitása miatt az Asc kiválóan alkalmas a ROS-ok semlegesítésére. Nem enzimatikus antioxidánsként az Asc képes semlegesíteni a szinglet
O
O— OH HO O
HO O
O• O—
HO O HO
O
O O HO O O HO
OH
O OH OH O
HO
MDA
DHA (biciklikus) DHA Asc
2,3-diketo-L-gulonát
D-xilulóz 5-P L-eritrulóz + oxálsav 4-oxalil L-treonsav
L-treonsav + oxálsav L-tartársav + glikolaldehid
APX/ AO MDAR
H2O DHAR
MDA Asc
oxigént (1O2), a hidroxilcsoportot (OH•), a tokoferol-gyököket, valamint a lipid-peroxilgyököket (Munné-Bosch, 2005). Emellett hatékonyan semlegesíti az aminosav-gyököket (tirozin, triptofán; Domazou és mtsai, 2009; Gebicki és mtsai, 2010).
Az Asc alapvető szerepet játszik a ROS-ok enzimatikus semlegesítésében is. A kloroplasztiszban a Mehler reakció során szuperoxid (O2-) keletkezik az I. fotokémiai rendszer (PSI) akceptor oldalán, az O2 ferredoxin (Fd) általi redukciója által (Asada, 2006). A O2--t a szuperoxid-diszmutáz H2O2-dá redukálja, amit az Asc-peroxidáz (APX) vízzé alakít. Az MDA-t a Fd vagy az Asc-glutation ciklus alakítja vissza Asc-tá. A monodehidro-aszkorbát reduktáz (MDAR) és a dehidro-aszkorbát reduktáz (DHAR) NADPH-t használ az Asc regenerálására növényekben (Asada, 2006; Foyer és Shigeoka, 2011) és mikroalgákban egyaránt (Curien és mtsai, 2016).
Az aszkorbát enzimatikus reakciókban betöltött szerepei
A ROS mennyiségének szabályozásában játszott szerepe mellett az Asc számos enzimatikus reakcióban vesz részt a növényi sejtben (2. ábra). Működhet chaperone-ként az enzimek aktív centrumában található Fe2+-centrumokat stabilizálva, katalitikus szereppel bírhat, vagy szubsztrátként vehet részt a különböző enzimatikus reakciókban.
A 2-oxoglutarát-függő dioxigenázok (2-ODD) aktív centrumában Fe található, amelyet az Asc chaperonként stabilizál (Myllyharju és Kivirikko, 1997). A 2-ODD enzimek szerepet játszanak a kollagén bioszintézisében, ezért alakul ki az emberben Asc hiányában skorbut (Myllyharju, 2003). Újabban pedig felfedezték, hogy 2-ODD enzimek részt vesznek a hiszton és DNS demetilációban, ezáltal a génexpresszió epigenetikus szabályozásában (Monfort és Wutz, 2013; Young és mtsai, 2015; Blaschke és mtsai, 2013; Camarena és Waszczak, 2016).
A növényekben számos 2-ODD enzim található, amelyek részt vesznek az etilén (Bassan és mtsai, 2006; Smith és mtsai, 1992; McGarvey és Christoffersen, 1992) az abszcizinsav és a giberrelinek bioszintézisében (López-Carbonell és mtsai, 2006; Pastori, 2003), valamint az auxin degradációjában (Palmieri és Giovinazzi, 1982; Porco és mtsai, 2016). A 2-ODD enzimek részt vesznek különböző szekunder metabolitok, mint például az antocianinok (Page és mtsai, 2012) és a glükozinolátok bioszintézisében is (Kliebenstein és mtsai, 2001).
A violaxantin-deepoxidáz (VDE) a kloroplasztisz tilakoid lumenjében található enzim, amely a violaxantin zeaxantinná történő, fényfüggő átalakítását végzi (Hallin és mtsai, 2016).
Magasabb rendű növényekben a VDE enzim által katalizált folyamatban az Asc redukálószerként vesz részt. A zeaxantin felhalmozódása növeli a fotoprotektív szereppel bíró hődisszipáció mértékét (nem-fotokémiai kioltás, NPQ; Ballottari és mtsai, 2014; Holt és mtsai, 2005; Niyogi és mtsai, 1998), valamint a zeaxanthin a ROS-ok semlegesítésében is részt vesz (Dall’Osto és mtsai, 2010; Dall’Osto és mtsai, 2012). Felfedeztük, hogy a magasabb rendű növényekkel ellentétben a zöldalgák VDE enzime nem igényel redukálószerként Asc-ot (ld. IV. 5.
fejezet; Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2020).
2. ábra. Az Asc növényekben betöltött szerepei (Tóth és mtsai, 2018).
Az Asc Fe3+-redukciós képessége arra utal, hogy jelentős szerepet játszhat a vas felvételében. A vas felvétele során első lépésben a FRO (ferric reduction oxidase) a Fe3+-at redukálja, amelyet az IRT (iron-regulated transporter) vas-transzporter általi Fe2+-felvétel követ.
Ez a folyamat extracelluláris savasodással jár a H+-ATP szintáz aktivitása és citromsav-kiáramlás révén. Kimutatták, hogy vasfelvétel során Asc-kiáramlás is történik, és az Asc részt vesz az Fe3+
redukciójában (Grillet és mtsai, 2014). Az Asc-nak hasonló szerepe lehet zöldalgákban is, ugyanis vashiány esetén drasztikus Asc koncentráció-emelkedés figyelhető meg (Urzica és mtsai, 2012a).
Az aszkorbát hatása a II. fotokémiai rendszer működésére
A vízbontó komplex (OEC) károsodása esetén (amely felléphet hőstressz hatására), redukáló tulajdonságainak köszönhetően az Asc képes elektronokat szolgáltatni a II. fotokémiai rendszer (PSII) számára (Tóth és mtsai, 2007; Tóth és mtsai, 2009; IV. 1. fejezet). Az Asc-tól a PsbA (D1) fehérje redox aktív tirozin Z (TyrZ+) aminosaváig terjedő elektronátadás folyamata élettani szempontból releváns, ugyanis lelassítja a PSII reakciócentrumok inaktiválódását és lehetővé teszi a hőstresszből történő gyorsabb felépülést (részletesen a IV. 2. fejezetben;
Függelék: Tóth és mtsai, 2011). Emellett az Asc elektronokat szolgáltat a PSII-höz és a PSI-hez a NADP-almasav enzim típusú C4 növények hüvelyparenchima sejtjeiben, amelyek vízbontó képessége mérsékelt. Ennek a folyamatnak az élettani szerepe valószínűleg az, hogy PSI ciklikus elektrontranszportot és ezáltal az ATP szintézist tart fenn a hüvelyparenchima sejtekben (Ivanov és mtsai, 2007).
Az aszkorbát jeltátvitelben és epigenetikai szabályozásban betöltött szerepei
Az Asc jelentősen befolyásolja a H2O2 koncentrációját, aminek köszönhetően közvetett módon részt vesz a különböző jelátviteli folyamatokban, mint pl. az abszciszinsav-jelátvitelben (López-Carbonell és mtsai, 2006; Pastori, 2003), a retrográd jelátvitelben (Exposito-Rodriguez és mtsai, 2017), valamint szerepet játszik a sztómazáródás szabályozásában (Chen és Gallie 2004; Fotopoulos és mtsai, 2008; Shi és mtsai, 2012).
Fotoszintézis alternatív elektrondonora
Szabadgyökök semlegesítése Redox jelátvitel
Sejtosztódás Sejtfal bioszintézis
Génexpresszió szabályozása
Enzimaktivitás szabályozása Fénystressz elleni védelem
Az Asc kulcsszerepet játszik az epigenetikai szabályozásban azáltal, hogy fokozza a Jumonji-C domént tartalmazó hiszton-demetilázok és a TET fehérje aktivitását (Camarena és Wang, 2016), valamint a Chlamydomonas reinhardtii zöldalgában egy TET homológ, a 5mC-módosító enzim (CMD) Asc-ot használ szubsztrátként (Xue és mtsai, 2019). E folyamatok révén az Asc befolyásolhatja az embriófejlődést, a sejtek megnyúlását és a sejtciklust is (Chen és Gallie, 2012), illetve közvetett módon a fotoprotektív folyamatokat (Xue és mtsai, 2019).
I. 2. Az aszkorbát metabolizmusa magasabb rendű növényekben és zöldalgákban
Az aszkorbát bioszintézise
Az Asc bioszintézise a magasabb rendű növényekben a Smirnoff-Wheeler útvonalon zajlik (Wheeler és mtsai, 1998; 3. ábra). A folyamat során a citoplazmában a D-glükóz-6-P különböző intermediereken keresztül GDP-L-galaktózzá alakul. Ezt követi az Asc-bioszintézis első elkötelezett lépése, amelyet a VTC2 és VTC5 gének által kódolt enzim, a GDP-L-galaktóz foszforiláz (GGP) katalizál. A képződött L-galaktóz 1-P ezután L-galaktózzá, majd L-galaktono-1,4-laktonná alakul a citoplazmában. Az utolsó lépés a mitokondriumban történik meg, ahol az I. mitokondriális komplexhez kapcsolódó 1,4-lakton-dehidrogenáz az L-galaktono-1,4-lakton Asc-tá történő oxidációját katalizálja (Millar, 2003).
3. ábra. Az Asc-bioszintézis lépései magasabb rendű növényekben nagyrészt a citoszolban történnek, kivéve az utolsó lépést, mely a mitokondriumban játszódik le. GMP, GDP-D-mannóz pirofoszforiláz;
GME, GDP-D-mannóz-3’,5’-epimeráz; GGP, GDP-L-galaktóz foszforiláz; GPP, L-galaktóz-1-foszfát foszfatáz; GDH, galaktóz dehidrogenáz; GLDH, L-galaktono-1,4 lakton dehidrogenáz.
Növényekben a Smirnoff-Wheeler útvonalon kívül létezhet három, csekély jelentőségű alternatív útvonal: i) az L-gulóz útvonal (Wolucka és Van Montagu, 2007), ii) a galakturonát útvonal (Cruz-Rus és mtsai, 2010), (iii) és mio-inozitol útvonal (Lorence és mtsai, 2004).
D-mannóz-1-P
GDP-D-mannóz
GDP-L-galaktóz
L-galaktóz-1-P
L-galaktóz
L-galaktono-lakton
L-aszkorbát GMP
GME
GGP
GPP
GDH
GLDH
citoszolmitokondrium
Elképzelhető, hogy a galakturonát (más néven pektin-lebontó) útvonal szerepet játszik a termések érése során (Badejo és mtsai, 2012). Növényi levelekben azonban egyik alternatív útvonalra sem találtak egyértelmű bizonyítékot, sőt, A. thaliana VTC2/VTC5 dupla mutánsok csak Asc-tal kiegészített táptalajon képesek a túlélésre (Dowdle és mtsai, 2007), bizonyítva, hogy a Smirnoff-Wheeler útvonal elengedhetetlen a fiatal növények túléléséhez.
Az Asc-bioszintézis sebességét a GDP-L-galaktóz-foszforilázt kódoló VTC2 gén expressziós szintje nagy mértékben meghatározza, amely erősen függ a fényintenzitástól, és áttételesen a fotoszintetikus elektrontranszporttól (Kiyota és mtsai, 2006); e folyamat részletei azonban nem ismertek. Magasabb rendű növényekben az erős fényintenzitás (Dowdle és mtsai, 2007; Müller-Moulé és mtsai, 2003) mellett UV-B (Gao és Zhang 2008), ózon (Caregnato és mtsai, 2013), és sóstressz (Huang, 2005) hatására is mintegy két-háromszorosára nő az Asc-tartalom néhány nap leforgása alatt. Emellett magasabb rendű növényekben a VTC2 gén expresszióját és ezáltal az Asc-bioszintézist a cirkadián óra is szabályozza (Dowdle és mtsai, 2007).
Jótékony élettani hatásai miatt régóta folynak próbálkozások a növények Asc-tartalmának fokozására. Ennek a legkézenfekvőbb módja az, hogy a bioszintézisében részt vevő enzimeket túlexpresszálják. A. thaliana esetében különböző Asc-bioszintézis gének konstitutív expressziójával a levél Asc-tartalma kb. 2.5-szeres növekedését mutatott (Lisko és mtsai, 2014);
viszont átmeneti expressziós rendszerek esetén (pl. a kivi GGP, és a GME kifejeztetése dohánylevelekben) az Asc-tartalom akár nyolcszoros növekedése is megfigyelhető volt (Bulley és mtsai, 2009). A bioszintézis útvonal génjeinek konstitutív túlexpresszáltatása által elért mérsékeltebb növekedés legvalószínűbb oka az Asc által a VTC2 expressziójára (Dowdle és mtsai, 2007) és a GGP transzlációjára gyakorolt erőteljes visszacsatolási mechanizmus lehet (Laing és mtsai, 2015).
Az Asc bioszintézise és szabályozása kevésbé ismert nem edényes növényekben. A mohák és a zöldalgák mintegy századannyi Asc-ot tartalmaznak, mint a magasabb rendű növények (Gest és mtsai, 2013; Wheeler és mtsai, 2015), ezért felmerül a kérdés, hogy ezek a fajok hogyan tudnak megbirkózni a környezeti stresszhatásokkal ilyen alacsony Asc-tartalom mellett. Bizonyítottuk, hogy az Asc-bioszintézis a zöldalgák esetében is a Smirnoff-Wheeler útvonalon történik, valamint kimutattuk, hogy az élettani Asc-koncentrációtartományban nem működik negatív visszacsatolási mechanizmus, sőt, pozitív visszacsatolási (feedforward) szabályozás révén az Asc-bioszintézis nagyon gyors és többszörös növekedést mutat stresszkörülmények között zöldalgákban (részletesen a IV. 4. fejezetben; Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2017).
Az aszkorbát regenerációja
Az Asc mennyiségét nem csak a bioszintézise, hanem annak regenerációja is szabályozza.
Az Asc különféle reakciókban, például ROS-ok semlegesítésekor, a violaxantin deepoxidációja
során a tilakoid lumenben, illetve a PSII felé történő elektronátadás során MDA-vá oxidálódik.
Az MDA a kloroplasztisz sztrómában a Fd-nal vagy MDAR-rel történő reakcióban visszaalakulhat Asc-tá (Asada, 2006). Az MDA a tilakoid lumenben (Fd és MDAR hiányában), spontán módon Asc-tá és a DHA-vá alakul, majd a DHA ezidáig nem azonosított Asc transzporterek útján a tilakoid lumenen keresztül átjut a sztrómába (Mano és mtsai, 2004). A DHAR alapvető szerepet játszik az Asc-koncentráció kívánt szintjének fenntartásában mind a kloroplasztiszban, mind más sejtkompartmentumokban: ha a DHA nem redukálódik, visszafordíthatatlan hidrolízisen megy keresztül (1. ábra), amelynek eredményeként az Asc mennyisége csökken. Mivel az Asc fontos redukálószer a növényekben, a DHAR hozzájárul a sejtek redox állapotának szabályozásához is.
A DHAR túltermeltetésével az Asc-tartalom megközelítőleg háromszoros növekedése érhető el magasabb rendű növényekben, ami jobb növekedést és nagyobb hőstresszel és metilviologén (MV) kezelésel szembeni toleranciát eredményezett (Wang és mtsai, 2010).
Viszont a DHAR túltermelő növények érzékenyebbek voltak a szárazságstresszre, mivel a DHA/Asc arány csökkenése folytán a H2O2 szignálmolekula mennyisége lecsökkent, ami által a sztómazáródás szabályozása nem volt megfelelő (Chen és Gallie, 2004).
Az aszkorbát lebontása
A növények Asc-tartalmát annak lebontása is szabályozza (1. ábra). A magasabb rendű növényekben az Asc lebomlása elsősorban DHA-n keresztül történik, amelynek a végtermékei az L-treonát és az oxalát, melléktermékként pedig H2O2 képződhet; a szőlőfélék (Vitaceae) családjában az Asc az L-tartarát útvonalon is bomlik (Green és Fry 2005; Truffault és mtsai, 2017). [14C] Asc jelölést használva, Truffault és mtsai (2017) megállapították, hogy az Asc lebomlása sötétben fokozottabb, mint fényben, és naponta a teljes Asc-tartalom mintegy 63%-a bomlik le. Megjegyzendő, hogy 63%-az Asc lebomlás63%-a 63%-az érés során fokozódik, és 63%-a keletkezett H2O2 és hidroxil gyök (OH•) hozzájárulnak a sejtfalak fellazulásához (Dumville és Fry, 2003).
Felfedeztük, hogy a zöldalgákban az Asc lebontása nagyon gyors: fény-sötét átmenet során az Asc fél-életideje mintegy 2 óra (Függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2017); viszont az Asc lebomlási útja ismeretlen és még az is tisztázásra vár, hogy vajon az Asc lebontásának sebessége zöldalgákban szabályozott módon zajlik-e.
I. 3. Aszkorbát-transzporterek
Mérete és negatív töltése miatt az Asc nem tud szabadon átdiffundálni a biológiai membránokon, és valószínűleg a semleges DHA sem elegendően lipofil ahhoz, hogy egyszerű diffúzióval hatékonyan átjusson a lipid membránokon (Rose, 1988). Az Asc bioszintézisének utolsó lépése a mitokondriumokban történik, ezért az Asc transzporterek valószínűleg nélkülözhetetlenek az Asc optimális koncentrációjának (mM tartomány) fenntartásához a
különféle sejkompartmentumokban, beleértve a kloroplasztiszt, a sejtmagot, a citoszolt, a sejtfalat és a vakuólumot, valamint az apoplasztot (4. ábra, Fernie és Tóth, 2015).
Ezidáig növényekben molekuláris szinten egyetlen Asc transzportert azonosítottak, a kloroplasztisz burkolómembránjában található, a foszfát-transzporterek családjába tartozó AtPHT4;4 fehérjét (Miyaji és mtsai, 2015). Az AtPHT4; 4 knockout mutánsok kloroplasztiszaiban az Asc-szint alacsonyabb volt, mint a vad típusban, aminek következtében az NPQ lecsökkent.
A növény növekedését és a fotoszintézis hatékonyságát azonban nem befolyásolta az AtPHT4;4 hiánya, ami arra utal, hogy az AtPHT4;4 mellett létezik más Asc-transzporter is a kloroplasztiszban burkolómembránjában (Fernie és Tóth, 2015).
4. ábra. Azonosított és feltételezett Asc-transzporterek a növényi sejtben. Az Asc-bioszintézis utolsó lépése a mitokondriumban játszódik le, ahonnan az Asc az összes többi sejtorganellumba szállítódik. A következő Asc-transzporterek ismertek: 1) DHA transzporter a plazmamembránban, 2) egy DHA transzporter a mitokondriumban, amely valószínűleg a glükóz transzporterekhez hasonló, 3) AtPHT4;4 a kloroplasztisz burkolómembránjában. Az ábrán láthtó a többi feltételezett, de még nem jellemzett és azonosított Asc- és DHA-transzporter. Rövidítések: csz, citoszol; kp, kloroplaszt; m, mitokondrium; n, nukleusz; v, vakuólum (Fernie és Tóth, 2015).
A DHA plazmamembránon keresztül történő felvételét transzporterek végzik, amelyek a korábbi feltételezésekkel ellentétben nem glükóz-carrierek (Szarka és mtsai, 2013). Emellett anion-csatornán át történő Asc-effluxot is kimutattak (Makavitskaya és mtsai, 2018), valamint a mitokondriumban DHA transzporter-aktivitást mértek, amely hasonlóságot mutat a glükóz transzporterekével (Szarka és mtsai, 2004). E transzporterek molekuláris azonosítása azonban még nem történt meg. Ezen kívül nagyon valószínű, hogy Asc- és DHA-transzporterek találhatók a tilakoid membránban is, amelyek lehetővé teszik a DHA hatékony regenerálódását és a folyamatos Asc-ellátást a tilakoid lumenben (Fernie és Tóth, 2015). Miyaji és mtsai (2015) feltételezték, hogy az AtPHT4;1 egy tilakoid membránban lokalizált Asc transzporter lehet, ám később kiderült, hogy ez valószínűleg téves hipotézis volt (Karlsson és mtsai, 2015). A
Asc n
v
kp m csz
zöldalgákban és az egyéb egysejtű fotoszintetizáló fajokban eddig nem azonosítottak egyetlen Asc-transzportert sem.
I. 4. A magas aszkorbát-koncentráció lehetséges negatív hatásai növényekben
Sokáig úgy gondolták, hogy a ROS-ok negatívan befolyásolják a sejtek működését és a növények életképességét. Az utóbbi években paradigmaváltás történt, ugyanis egyre több eredmény igazolja, hogy a ROS-ok jelentős szerepet játszanak a környezeti akklimatizációban és az ahhoz szükséges jelátvitelben (Foyer és Noctor, 2016; Loiacono és De Tullio, 2012;
Inupakutika és mtsai, 2016; Mittler, 2017). A ROS-ok emellett szükségesek a fehérje transzlációhoz, és befolyásolják a sejtek redoxpotenciálját, amelyek hatással van a különböző redox-érzékeny fehérjék működésére.
Az Asc mennyisége meghatározza a kloroplasztiszban található APX-ok aktivitását, amely közvetlen hatással van a H2O2 szintre, amely retrográd szignálként működik (Maruta és mtsai, 2016). A DHAR fentebb említett túltermeltetése az Asc-tartalom többszörös növekedését eredményezte, de ennek következtében a növények kevésbé alkalmazkodtak az szárazságstresszhez a csökkent H2O2-jelátvitel miatt (Chen és Gallie, 2004). Ebben az összefüggésben a növényi antioxidáns rendszer szerepe a ROS mennyiségének szabályozása vagy szükség esetén csökkentése, nem pedig annak teljes semlegesítése. Ez azt is jelentheti, hogy a növények különféle szabályozási mechanizmusokat fejleszthettek ki az antioxidánsok túltermelésének elkerülésére, mint például az Asc által a VTC2 expressziójára és transzlációjára gyakorolt negatív visszacsatolási mechanizmust (Dowdle és mtsai, 2007; Laing és mtsai, 2015).
A magas Asc-tartalmú növények előállítását illetően ez azt jelentheti, hogy még ha sikerül is kiküszöbölni az Asc-bioszintézis szabályozására szolgáló visszacsatolási mechanizmusokat, a növények valószínűleg nem mutatnának növekedett stressz-toleranciát, hanem e helyett az akklimatizációs válaszok hatékonysága csökkenne. A megoldás a feltételezett vakuoláris Asc transzporterek (Dumville és Fry, 2003) túltermeltetése lehet az Asc-bioszintézisben részt vevő enzimek túltermeltetése mellett, amely lehetővé tenné az Asc felhalmozódását a vakuólumban, a többi sejtkompartmentumban az élettani Asc koncentrációk fenntartása mellett (Tóth és mtsai, 2018).
Az Asc feltételezett negatív szerepeit illetően figyelembe veendő az Asc redukáló tulajdonsága. A reduktánsok felhalmozódása megváltoztathatja a sejtek redox egyensúlyát, ami rendkívül fontos a redox-függő szabályozás alatt álló enzimek számára. A redox egyensúly megváltozása a kloroplasztiszban zajló fotoszintetikus elektrontranszport folyamatokat is megzavarhatja, amely végső soron fotoinhibícióhoz vezethet (Scheibe és mtsai, 2005;
Zaffagnini és mtsai, 2019). Felfedeztük, hogy a zöldalgák kénmegvonása során az Asc olyan mértékben felhalmozódhat (a ≅100 µM-osról a mM-os tartományba), hogy redukálja és inaktiválja az OEC Mn-klaszterét (részletesen a IV. 6. fejezetben, Függelék: Nagy és mtsai, 2016;
Nagy és mtsai, 2018). Magasabb rendű növények tilakoid lumenjében néhány mM-os koncentrációban található meg Asc, melynek redukáló hatása ellen az OEC-t a külső fehérjék védik; viszont hosszú sötétadaptálásnak kitett növények esetében ez a védőhatás nem érvényesül kellő mértékben, és az OEC inaktiválódik (részletesen a IV. 3. fejezetben, Függelék:
Podmaniczki és mtsai, 2021).
Az Asc speciális esetekben prooxidánsként is viselkedhet. A Fenton-reakció izolált tilakoid membránokban felléphet (Upham és Jahnke, 1986). Az apoplasztban pedig hozzájárul a poliszacharidok nem enzimatikus vágásához, ami a sejtfal meglazulásához vezet a gyümölcsök érése (Dumville és Fry, 2003; Fry és mtsai, 2001; Müller és mtsai, 2009; Schopfer és mtsai, 2002) és a sejtek expanziója során (KC és mtsai, 2005; Muñoz-Montesino és mtsai, 2014).
Az Asc lebomlása során H2O2 is képződik (Green és Fry 2005, Kärkönen és Fry, 2006), ami szintén hozzájárulhat az Asc prooxidáns hatásához. Ezért stresszkörülmények között (amikor az Asc oxidációja nagyobb sebességgel zajlik, mint a regenerációja) előfordulhat, hogy az Asc oxidációja során jelentős mennyiségű H2O2 képződik, és így a stresszállapot tovább súlyosbodhat.
Az Asc tehát sokkal több, mint antioxidáns. Az Asc változatos élettani szerepei és lehetséges káros hatásai alapján úgy tűnik, hogy koncentrációjának megfelelő tartományban történő fenntartása nagy élettani jelentőséggel bír a növények számára.
Az Asc-koncentráció emelése ezért nem csak a bioszintézis fokozásával, hanem további szabályozási pontként az Asc lebomlásának és transzportjának a módosításával érhető el;
mindkét mechanizmus megértése, megismerése még további vizsgálatokat igényel, amelyek végső soron elvezethetnek a mezőgazdasági termények Asc-tartalmának jelentős fokozásához.
II.CÉLKITŰZÉSEK
A PhD dolgozatom (2006) megvédését követően tudományos munkásságom egyik fő célja az Asc növényekben és zöldalgákban betöltött szerepeinek és metabolizmusának alaposabb felderítése volt. Ebben a témakörben levelező szerzőként leközölt cikkeim célkitűzései a következők voltak:
1. A PSII alternatív elektrondonorának azonosítása (IV.1. fejezet; függelék: Tóth és mtsai, 2009).
2. Az Asc alternatív PSII elektrondonorként betöltött élettani szerepének meghatározása (IV.
2. fejezet; függelék: Tóth és mtsai, 2011; összefoglaló cikk: Tóth és mtsai, 2013).
3. Az Asc vízbontó komplex működésére gyakorolt hatásának vizsgálata sötét-indukált szeneszcencia során (IV. 3. fejezet; függelék: Podmaniczki és mtsai, 2021).
4. A zöldalgák Asc-bioszintézisének vizsgálata (IV. 4. fejezet; függelék: Vidal-Meireles és mtsai, 2017; összefoglaló cikk: Tóth és mtsai, 2018).
5. Az Asc szerepének meghatározása a zöldalgák NPQ folyamataiban (IV. 5. fejezet; függelék:
Vidal-Meireles és mtsai, 2020).
6. Az Asc szerepének feltárása a zöldalgák H2-termelésében (IV. 6. fejezet; függelék: Nagy és mtsai, 2012; Nagy és mtsai, 2016; Nagy és mtsai, 2018; összefoglaló cikk: Tóth és Yacoby, 2019).
III. ALKALMAZOTT ANYAGOK, MÓDSZEREK
III. 1. Arabidopsis thaliana és Chlamydomonas reinhardtii mutánsok, vonalak
A magasabb rendű modellszervezetünk a lúdfű (Arabidopsis thaliana) volt.
Kísérleteinkhez Asc-deficiens (vtc2-1, vtc2-3, vtc2-4) mutánsokat, Asc-túltermelő (miox-4) transzgénikus vonalakat, valamint psbo1 és psbr mutáns A. thaliana növényeket használtunk fel.
A növényeket növénynevelő kamrában, standard körülmények között neveltük. A stresszkezelések magukban foglaltak magas fényintenzitáson történő rövid vagy hosszú időtartamú kezeléseket, valamint rövid idejű hőstresszt. A biofizikai mérések legnagyobb részben intakt leveleken történtek, egyes esetekben tilakoid membránokat izoláltunk.
A zöldalga-modellszervezet a Chlamydomonas reinhardtii volt, amelynek a következő törzseit használtuk a kísérleteinkhez: CC-124, CC-849, CC-400, CC-409, CC-125 (www.chlamycollection.org), valamint az S-01 jelű vonalon (Nagy és mtsai, 2012, 2015) is végeztünk kísérleteket. Ezek mellett a Chlamydomonas Library Project (CLiP)-ben azonosítottunk egy Asc-deficiens inszerciós mutánst, amelyet Crvtc2-1-nek neveztünk el, illetve magunk állítottunk elő vtc2-amiRNS vonalakat.
A C. reinhardtii-t mixotróf vagy fotoautotróf módon neveltük a kísérletek céljainak
A C. reinhardtii-t mixotróf vagy fotoautotróf módon neveltük a kísérletek céljainak