IV. E REDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
IV. 1. Az aszkorbát a II. fotokémiai rendszer alternatív elektrondonora
IV. 1. Az aszkorbát a II. fotokémiai rendszer alternatív elektrondonora
Bevezetés: A hőstressz fotoszintetikus elektrontranszportra gyakorolt hatása
A növények és a fotoszintetizáló mikroorganizmusok végzik a napfény energiájának átalakítását, melynek során megkötik a légköri CO2-t, O2-t termelnek, valamint cukrokat és más értékes tápanyagokat állítanak elő. Az évmilliók alatt, a fotoszintézis során képződött biomassza a fosszilis energiahordozók forrása is, melyet ma olyan mértékben használunk fel, hogy az ezzel együtt járó CO2-emissziót a Földet borító növényzet nem képes kompenzálni, ami által a légköri CO2 koncentráció és a Föld átlaghőmérséklete folyamatosan emelkedik. A növények és a fotoszintetizáló mikroorganizmusok felelősek a primér biomassza termeléséért is, amely lehetővé tette a heterotróf szervezetek és végső soron az emberi faj kialakulását a Földön.
Az O2-fejlődésért a PSII egyik fő komponense, az OEC a felelős, amely a kloroplasztisz tilakoid membrán rendszerében, annak lumen felőli oldalán helyezkedik el (5. ábra). Az OEC központi eleme a Mn-klaszter, amelyet négy Mn-ion, egy Ca2+ és egy Cl- alkot, amelyet a lumen felőli oldalon fehérje alegységek (növényekben és zöldalgákban PSBO, PSBP, PSBQ, PSBR) vesznek körbe (Allahverdiyeva és mtsai, 2013; Bricker és mtsai, 2012). A PSII reakciócentrumban lezajló töltésszeparációk hatására a Mn-klaszter S0 kiindulási állapotból S1,
5. ábra. A magasabb rendű növények fotoszintetikus elektrontranszportja. A kloroplasztiszban kódolt polipeptid alegységek zöld színnnel, a nukleuszban kódolt alegységek sárga színnel jelöltek.
Rövidítések: cytb6f: citokróm b6f komplex; Fd: ferredoxin; Lhc: klorofill a/b fénybegyűjtő pigment-protein komplexek; PC: plasztocianin; PQ: plasztokinon, PSI: I. fotokémiai rendszer; PSII: II.
fotokémiai rendszer; P680: a PSII elsődleges elektrondonora; P700: a PSI elsődleges elektrondonora;
QA: a PSII elsődleges kinon akceptora. Forrás: Allen és mtsai (2011).
S2, S3, S4 oxidációs állapotba kerül, ami a pozitív töltések összegyűjtését szolgálja a vízbontás számára. Az oxigén felszabadulása az S4 állapotnál következik be, amely során az S4 állapot S0 -ba alakul át, majd a vízbontó komplexbe két H2O molekula kötődik be, és ezzel helyreáll az S0
állapot (összefoglaló cikk: Lubitz és mtsai, 2019; Najafpour és mtsai, 2020). Az vízbontó komplexből az elektronok 0,1-0,8 ms alatt jutnak el az oxidált állapotú TyrZ-re, majd innen kb.
20 ns alatt a PSII reakciócentrumba, pontosabban a P680+-hoz (5. ábra).
A fotoszintézis folyamata számos környezeti stresszhatás során szenvedhet károsodást.
Hőstressz hatására az OEC külső fehérjéi (elsősorban a PSBO) leválnak a komplexről (Nash és mtsai, 1985; Enami és mtsai, 1994), amely együtt jár két Mn-ion, a Cl--ion, valamint a Ca2+-ion elvesztésével (Barra és mtsai, 2005; Popelkova és mtsai, 2011), ami végül az OEC teljes inaktivációját eredményezi. Hőstressz hatására a PSII akceptor oldalán zajló elektrontranszport lelassul (Ducruet és Lemoine 1985), valamint a PsbA (D1) és PsbD (D2) fehérjék is degradálódhatnak (De Las Rivas és Barber, 1997; Yoshioka és mtsai, 2006).
Rövid idejű hősokk hatására (40 s, 50°C-os vízfürdőben) a vízbontó komplexek teljes mértékben inaktiválódnak, ennek ellenére számottevő elektrontranszport-aktivitást figyeltünk meg a kezelt levelekben (Tóth és mtsai, 2005). Kimutattuk, hogy ilyen körülmények között a vízmolekulák helyett nagy mennyiségben jelenlévő, alternatív elektrondonorok juttatnak elektronokat a PSII-höz (Tóth és mtsai, 2007).
In vitro kísérletek alapján ismert volt, hogy számos vegyület képes PSII elektrondonorként viselkedni, mint pl. Asc, Mn2+, hidroxilamin, N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine (Katoh és San Pietro, 1967; Yamashita és Butler, 1968). Mano és mtsai (1997) kimutatták, hogy kémiai kezelésnek (TRIS-mosás) kitett izolált tilakoid membránokban a difenil-karbazid (DPC) és az Asc alternatív elektrondonorként hatnak, és folyamatos elektrontranszportot fenntartva védik a PSII reakciócentrumot a fotoinhibícióval szemben. Az is ismert volt, hogy aktív OEC-vel rendelkező izolált PSII reakciócentrumok számára az Asc alacsony hatékonysággal szolgáltat elektronokat (Mano és mtsai, 2004). Mindezek alapján feltételeztük, hogy az Asc a PSII alternatív elektrondonora in vivo. Hipotézisünk vizsgálatára hőstressznek kitett Asc-hiányos (vtc2-1 mutáns; Conklin és mtsai, 2000; Giacomelli és mtsai, 2006; Dowdle és mtsai, 2007) és Col-0 vad típusú A. thaliana növények elektrontranszport folyamatait hasonlítottunk össze.
Eredmények
A fotoszintetikus elektrontranszport folyamatok tanulmányozására a gyors klorofill-a fluoreszcencia indukciós görbét (OJIP) használtuk (Lazár, 2006; Schansker és mtsai, 2014; Tóth és mtsai, 2020). A fotoszintetikus apparátus fénnyel történő gerjesztésének hatására fluoreszcencia intenzitása a kezdeti F0 (O) értékről mintegy 300 ms alatt éri el maximális intenzitását (P vagy FM), a J és az I közbülső lépéseken keresztül, amelyek kb. 2 és 30 ms-nál alakulnak ki (6. ábra).
6. ábra. Hőkezelt (49°C, 40 s) és kezeletlen vad típusú (Col-0) és Asc-hiányos (vtc2-1) A. thaliana levelek gyors klorofill-a fluoreszcencia (OJIP) tranziensei. Az O szint a minimális (F0) fluoreszcenciát jelzi, a J és az I két közbülső lépés, a P érték pedig a maximális fluoreszcencia (FM) értéke. Az 1000 ms-nál megjelenő fluoreszcencia intenzitás-emelkedés az Asc-függő PSII-elektrontranszport jelenlétét mutatja.
Hőkezelés hatására az OJIP kinetika jelentősen megváltozik: A vízbontó komplex inaktivációját jelzi a K-lépés kb. 300 µs-nál, majd 1000 ms-nál megjelenik egy második csúcs, amelynek az intenzitása alacsonyabb az Asc-hiányos vtc2-1 mutánsban, mint a vad típusban, tehát intenzitása függ a levelek Asc-tartalmától (6. ábra; Tóth és mtsai, 2009).
Kidolgoztam egy dupla fényimpulzuson alapuló módszert, amellyel inaktív vízbontással rendelkező mintákban meghatározható az elektronátadás félideje (t1/2) az alternatív donor és a TyrZ+ között. Vad típusú A. thaliana növényekben a t1/2 kb. 25 ms-nak, míg a vtc2-1 mutánsban kb. 55 ms-nak adódott (7. ábra). Az eredmények alapján kijelenthető, hogy az Asc a PSII alternatív elektrondonora in vivo.
7. ábra. Az Asc-tól a PSII-höz történő elektronátadás félidejének meghatározása hőkezelt (49°C, 40 s) A.
thaliana levelekben a K lépés regenerációjának segítségével. Az első 5 ms-os fényimpulzust 2,3 ms-tól 200 ms-ig tartó sötétperiódus, majd a 2. fényimpulzus követi (A). A K lépés regenerációját a F20µs/F300µs
értékek alapján számoltunk ki vad típusú (Col-0) és Asc-hiányos (vtc2-1) növényekben (B). A K lépés regenerációja (vagyis az Asc-PSII elektronátadás sebessége) külsőleg hozzáadott Asc-tal (20 mM) növelhető (C).
Következtetéseinket 820 nm-es abszorbanciamérések is alátámasztották, valamint termolumineszcencia mérések segítségével megállapítottuk, hogy az Asc-tól az elektronok a PSII-höz a TyrZ+ közvetítésével jutnak el (függelékben: Tóth és mtsai, 2009).
0
Időintervallum (ms) Időintervallum (ms)
A B C
Összefoglalás
Megállapítottuk, hogy az OEC hővel történő inaktivációját követően a vízmolekulák helyett az Asc szolgáltat elektronokat a PSII számára. Az Asc-PSII elektrontranszport folyamatos, vad típusú növényekben kb. 25 ms-os félidővel játszódik le.
A fejezet alapjául az alábbi levelező szerzős közlemény szolgált, mely szerkesztői ajánlással jelent meg:
Tóth SZ, Puthur JT, Nagy V, Garab G (2009) Experimental evidence for ascorbate-dependent electron transport in leaves with inactive oxygen-evolving complexes. Plant Physiol 149: 1568-1578.
IV. 2. Az aszkorbát alternatív elektrondonorként lassítja a donor-oldali fotoinhibíciót
Bevezetés: A donor-oldal által indukált fotoinhibíció
A természetben a hőstressz sokszor együtt jár a fénystresszel. Ez a két stresszfaktor együttesen a PSII inaktivációját és fotooxidációját okozhatják (Havaux, 1993; Abrego és mtsai, 2008). Amennyiben hőstressz által inaktiválódik az OEC, a PSII reakciócentrumban erősen oxidáló komponensek, P680+, TyrZ+, szuperoxid (Chen és mtsai, 1995), hidroxilgyökök (Spetea és mtsai, 1997) halmozódnak fel, aminek következtében a PSII reakciócentrum teljes mértékben inaktiválódhat (Callahan és mtsai, 1986; Blubaugh és Cheniae, 1990; Jegerschöld és Styring, 1996; Pospíšil, 2016). Ezt a folyamatot donor oldal által indukált fotoinhibíciónak nevezzük.
Célunk az Asc PSII alternatív elektrondonorként a donor oldali fotoinhibícióban betöltött élettani szerepének tanulmányozása volt.
Eredmények
Feltételeztük, hogy az Asc alternatív elektrondonorként védi a PSII reakciócentrumot azáltal, hogy megakadályozza a P680+ felhalmozódását, amely oxidatív stresszhez, és végső soron a reakciócentrumok inaktivációjához vezet. Feltételezésünk bizonyítására vad típusú, Asc-deficiens (vtc2-3; Conklin és mtsai, 2000) és egy Asc-túltermelő MIOX4 transzgénikus vonalat (Lorence és mtsai, 2004) használtunk. A vtc2-3 mutáns a vtc2-1-hez hasonlóan EMS mutagenezissel előállított pontmutáns (Conklin és mtsai, 2000). A MIOX4 vonal esetében a feltételezett inozitol Asc-bioszintézis útvonal egyik első lépését katalizáló enzimet, a mio-inozitol oxigenázt kifejeztették, amelynek eredményeképpen a növények Asc-tartalma jelentősen megemelkedett (Lorence és mtsai, 2004; Nepal és mtsai, 2019). Bár eme útvonal élettani jelentősége máig vitatott (Wheeler és mtsai, 2015), az Asc, mint alternatív elektrondonor szerepének tanulmányozására a MIOX4 Asc-túltermelő vonal megfelelő volt.
Az Asc-túltermelő kissé nagyobb, míg az Asc-hiányos vtc2-3 mutáns kb. 30%-al kisebb a vad típusú növényhez képest (Müller-Moulé és mtsai, 2004; Függelék: Tóth és mtsai, 2011). A növények klorofillra vonatkoztatott Asc-tartalma a vtc2-3 mutánsban kb. 75%-kal alacsonyabb, míg a MIOX4 esetében kb. 60%-kal magasabb a vad típushoz képest (Függelék: Tóth és mtsai, 2011).
Az Asc élettani szerepének vizsgálatához a korábbi rövid és magas hőmérsékleten végzett hőkezelés (49°C, 40 s, IV. 1. fejezet) helyett a növények leveleit 40°C-on 15 percig kezeltük vízfürdőben, sötétben. Bár 40°C-os hőmérséklet érheti a természetben a növényeket (Burghardt és mtsai, 2008; Shahenshah és Isoda, 2010), még ez a hőkezelés sem élettani;
azonban fontos szempont volt a hőmérséklet és a fény hatásának elkülönítése, valamint hogy a leveleket egyenletesen, pontosan meghatározott időtartamig érje a magas hőmérsékleti stressz, és teljes mértékben szűnjön meg a vízbontó komplex aktivitása. A B TL sáv eltűnése jól mutatja, hogy ez mindhárom genotípus esetében megtörtént (Függelék: Tóth és mtsai, 2011).
A hőkezelés hatására a tilakoidmembrán permeabilitása csak kis mértékben emelkedett (Függelék: Tóth és mtsai, 2011). A kezeletlen vad típusú, Asc-hiányos és túltermelő A. thaliana levelek Fv/Fm értéke és OJIP kinetikája azonos volt. Hőkezelt (40°C, 15 perc) növények esetében az Asc-függő csúcs intenzitása (ld. 6. ábra az előző fejezetben) a vtc2-3 mutáns esetében kisebb, mint a vad típus esetében, a MIOX4 transzgénikus növény esetében pedig nem volt jelentős különbség (Függelék: Tóth és mtsai, 2011).
A hőkezelést követően a növényeket közepesen erős megvilágításnak tettük ki (300 µmól foton m-2s-1), hogy megvizsgáljuk a reakciócentrumok inaktivációjának sebességét. A kezelés hatására eltűnt az OJIP görbe K lépése és az Asc-függő csúcs (8. ábra). A K lépés intenzitása a fénykezelés idejének függvényében exponenciálisan csökkent. A K lépés 50%-os csökkenéséhez szükséges megvilágítási idő (t1/2) a vad típusú levelekben 2,8 perc, a vtc2-3 mutáns estében 1,2 perc , a MIOX4 transzgénikus növény esetében pedig 4,1 perc volt (8. ábra).
8. ábra. Vad típusú (Col-0), Asc-hiányos (vtc2-3) és Asc-túltermelő (MIOX4) A. thaliana növényeken mért OJIP tranziensek 3-(3,4-diklorofenil)-1,1-dimetilurea (DCMU) nélkül (A) és DCMU jelenlétében (C); a K lépés (F300µs-F20µs) csökkenésének félideje (B) és a DCMU jelenlétében mért FM érték csökkenése (D), hőkezelést (40°C, 15 perc) és folyamatos fénykezelést (fehér fény, 300 µmol m-2 s-1 fényintenzitás) követően (Tóth és mtsai, 2011).
A működőképes PSII reakciócentrumok relatív mennyiségét meghatároztuk oly módon, hogy a hő- és fénykezelés után a leveleket 3-(3,4-diklorofenil)-1,1-dimetilurea (DCMU)-kezelésnek tettük ki, amely által biztosítható a QA teljes redukciója a fluoreszcencia mérés
0 500 1000 1500 2000
0.01 1 100 10000
Kontroll (Col-0) 40°C 0 perc fény 40°C 10 perc fény 40°C 4 óra fény
0 500 1000 1500 2000
0.01 1 100 10000
kontroll (Col-0) 40°C 0 perc fény 40°C 10 perc fény 40°C 4 óra fény
Idő(ms) Idő(ms) Kl-afluoreszcencia(r.e.)Kl-afluoreszcencia(r.e.)
A
C
O
K J
I P
P
550 600 650 700 750 800
0 5 10 15 20
WT miox4 vtc2-3
1100 1300 1500 1700
0 20 40 60
WT miox4 vtc2-3
Kezelés időtartama (perc) F300µs-F20µsFM (DCMU)
D B
MIOX-4; t1/2≈4.1 min vtc2-3; t1/2≈1.2 min
Col-0; t1/2≈2.8 min
Kezelés időtartama (perc) MIOX-4; t1/2≈51 min
vtc2-3; t1/2≈10 min Col-0; t1/2≈23 min
során, inaktív OEC mellett is. A hőkezelés önmagában mintegy kb. 15%-os FM-érték csökkenést idézett elő (8.C ábra), majd a fénykezelés hatására a hőkezelt levelek FM értéke tovább csökkent. Az FM érték csökkenése szignifikánsan gyorsabb volt a vtc2-3 mutánsok esetében, mint a vad típusban (t1/2 kb. 10 ill. 23 perc), és a különbség még kifejezettebb az Asc-túltermelő transzgénikus növények esetében (t1/2 kb. 51 perc, 8. ábra). Hasonló félidőket kaptunk a kloroplasztisz fehérjeszintézis-gátló linkomicin (LM) jelenlétében is (Tóth és mtsai, 2011), ami bizonyítja, hogy kísérlet időtartama alatt nem történt jelentős fehérjeszintézis. Emellett a fénykezelés hatására a fluoreszcencia-kinetika DCMU jelenlétében lelassult (8.C ábra). A K lépés intenzitásának gyors csökkenése és a fluoreszcencia-kinetika lassulása arra enged következtetni, hogy a donor-oldali fotoinhibíció első lépéseként lelassul a TyrZ-P680+ közötti elektrontranszport, amit a PSII reakciócentrumok teljes inaktivációja követ.
Az Asc ROS-kioltó tulajdonsága jól ismert (Asada 2006, I. 1. fejezet), amely hozzájárulhat a hő-és fénystresszel szembeni védekezéshez. Annak bizonyítására, hogy az Asc nemcsak ROS-kioltóként, hanem alternatív elektrondonorként is védi a reakciócentrumokat, DPC-kezelést végeztünk, amely egy mesterséges PSII elektrondonor. A 2 mM-os DPC oldattal kezelt vtc2-3 mutáns növények reakciócentrumaiba ugyanolyan sebességgel érkeztek az elektronok, mint a vad típusban (adatok: Tóth és mtsai, 2011). A hőstresszt követő fénykezelés hatására a DPC oldatban inkubált vtc2-3 levelekben a K lépés amplitudója hasonló sebességgel csökkent (t1/2
2,5 perc), mint a vad típusban (t1/2 2,8 perc). Ez az eredmény bizonyította, hogy az Asc nem csak ROS-kioltóként, hanem PSII alternatív donorként is véd a fotoinhibícióval szemben.
Magas fényintenzitás hatására a PSII reakciócentrumok inaktiválódhatnak, amelyet a reakciócentrumok degradációja, különösen a PsbA protein mennyiségének csökkenése követ (Schuster és mtsai, 1988; Aro és mtsai, 1993; van Wijk és mtsai, 1994). Hőstressz hatására is csökkenhet a PsbA mennyisége, illetve szintézisének a gátlása is figyelhető volt (Yoshioka és mtsai, 2006; Yamashita és mtsai, 2008). Ezzel összhangban megfigyeltük, hogy a vad típusú hőkezelt növényekben a PsbA fehérje mennyisége kb. 20%-kal csökkent. A hőkezelést követő megvilágítás hatására 1 óra után további kb. 40%-kal, míg 4 óra elteltével kb. 65%-kal csökkent a PsbA mennyisége (9. ábra). Emellett a hőkezelt levelek 4 órás fénykezelése alatt a CP43 fehérje 70%-a, míg a PSBO 80%-a degradálódott. Tehát a PSII reakciócentrumok a hőkezelést követő fénykezelés hatására fokozatosan leépülnek.
Megvizsgáltuk az Asc hatását a PSII aktivitásának hőkezelést követő helyreállására, nevelési fényintenzitáson (100 μmol foton m-2 s-1). Csakúgy, mint a magasabb (300 μmol foton m-2 s-1) fényintenzitáson, itt is megfigyelhető a K lépés amplitúdójának csökkenése az első néhány órában, azonban 24 óra alatt jelentős helyreállás történik (Függelék: Tóth és mtsai, 2009). Megállapítottuk, hogy a helyreállás mértéke és sebessége jóval nagyobb a vad típusú és az Asc-túltermelő növényekben, mint az Asc-hiányosban. Megjegyzendő, hogy sötétben nem figyelhető meg helyreállás (Tóth és mtsai, 2005), magas fényintenzitáson pedig nagyon lassan, vagy egyáltalán nem történik meg.
9. ábra. A PsbA, CP43 és PSBO fehérjék mennyiségének relatív változása hő- (40°C, 15 perc) és fénykezelést (300 µmol foton m-2 s-1) követően vad típusú (Col-0) A. thaliana növényekben western blot analízis alapján (A) és denzitometrálással számszerűsítve (B).
Összefoglalás
Megállapítottuk, hogy hő- és fénykezelés hatására néhány perc alatt lelassul a TyrZ -P680+ elektrontranszfer, amit a PSII reakciócentrumok teljes inaktivációja és degradációja követ. Az inaktiválódás mértéke és sebessége Asc-függő. A hőkezelést követő helyreállás szintén Asc-függő, alátámasztva, hogy az Asc alternatív elektrondonorként jelentős fotoprotektív szerepet tölt be.
A fejezet alapjául az alábbi, levelező szerzős közlemények szolgáltak:
Tóth SZ, Nagy V, Puthur JT, Kovács L, Garab G (2011) The physiological role of ascorbate as photosystem II electron donor: protection against photoinactivation in heat-stressed leaves.
Plant Physiol 156: 382-392
Tóth SZ, Schansker G, Garab G (2013) The physiological roles and metabolism of ascorbate in chloroplasts. Physiol Plantarum 148: 161-175 (összefoglaló cikk)
IV. 3. Az aszkorbát hosszan tartó sötétségben inaktiválja a vízbontó komplexet
Bevezetés: Szeneszcencia a növényekben
A levelek öregedése egy kontrollált, aktív folyamat, amely transzkripciós és metabolikus szabályozás révén lehetővé teszi a tartaléktápanyagok lebontását, szállítását és újrahasznosítását a magvakban és más növényi szervekben (Maillard és mtsai, 2015; Liebsch és Keech, 2016). Lefolyása és mértéke függ a növények korától, bár számos környezeti tényező is befolyásolja, mint például a fényintenzitás, a vízellátottság és a kórokozók jelenléte (Jing és mtsai, 2009; Sade és mtsai, 2018). Az öregedés vizsgálatára gyakran alkalmazott kísérleti modellrendszer a növények több napig tartó sötétkezelése (Buchanan-Wollaston és mtsai, 2005), amellyel a szeneszcencia folyamatai szinkronizálhatók és egyszerűsíthetők. Hosszan tartó sötétségben az átmeneti keményítőtartalékok viszonylag gyorsan kimerülnek (Smith és Stitt 2007). A következő fázisban a lipidek és aminosavak felhasználása teszi lehetővé az anyagcsere fenntartását a sötétségben (Usadel és mtsai, 2008; Kunz és mtsai, 2009; Fan és mtsai, 2017). A sötétség hatására bekövetkező szeneszcencia kezdeti lépései között szerepel a hormonszint, a cukortartalom, és a redox homeosztázis változása, valamint szabadgyökök által indukált stresszhatás (Jing és mtsai, 2008; Zentgraf és Hemleben, 2008; Rosenwasser és mtsai, 2011).
A hosszan tartó sötétségben bekövetkező élettani változások egyike a fotoszintetikus aktivitás csökkenése, amelyet az FV/FM és a fotokémiai kioltási (qP) paraméterek csökkenése jelez, amely az OEC inaktiválódásának tulajdonítható (pl. Sobieszczuk-Nowicka és mtsai, 2018).
Később megkezdődik a fotoszintetikus komplexek - a PSII, a PSI, a cytb6f és az ATP szintáz - degradációja (Yamazaki és mtsai, 2000, Kunz és mtsai, 2009, Barros és mtsai, 2017). A kloroplasztisz szerkezetével kapcsolatban azt figyelték meg, hogy a tilakoid membránok néhány napos sötétség után megduzzadnak, megnő a plasztoglobulusok száma, majd a kloroplasztiszok szétesnek (Sobieszczuk-Nowicka és mtsai, 2018; Niu és Guo, 2012), ezt követően pedig a klorofill lebomlása figyelhető meg. A sötét-indukált szeneszcencia folyamatában az autofágia igen jelentős szerepet játszik (Barros és mtsai, 2017; Avin-Wittenberg és mtsai, 2018; Elander és mtsai, 2018; Fan és mtsai, 2019).
Az alábbiakban vad típusú (Col-0), Asc-hiányos (vtc2-4), psbo1, kettős psbo1 vtc2 és psbr1 mutáns A. thaliana mutánsok segítségével tanulmányoztuk a vízbontó komplex hosszan tartó sötétség történő inaktiválódását.
Eredmények
Korábbi in vitro kísérletekben kimutatták, hogy amennyiben az OEC külső fehérjéit kémiai kezelésekkel eltávolítják, az Asc redukálhatja a vízbontó komplexet (Tamura és mtsai, 1990). Arról azonban nem állt rendelkezésre információ, hogy az Asc in vivo is képes-e inaktiválni az OEC-t. E kérdés vizsgálatához Asc-deficiens A. thaliana mutánst használtunk, a
vtc2-4-et, amelyet korábban részletesen jellemeztek, és megállapították, hogy normál körülmények között a növekedése és fotoszintetikus hatékonysága megegyezik a Col-0 vad típuséval (Lim és mtsai, 2016). Emellett a kísérletekbe bevontunk egy psbo1, valamint egy psbr mutánst, amelyek háttere szintén a Col-0, és korábban mind molekuláris biológiai, mind pedig élettani szempontból részletesen jellemezték őket. A psbo1 mutáns esetében jelentősen csökkent OEC aktivitást és ezért lassabb növekedést figyeltek meg (Lundin és mtsai, 2007;
Allahverdiyeva és mtsai, 2009), míg a psbr mutáns hasonlóan viselkedik, mint a vad típus, leszámítva a valamivel lassabb QA-QB közötti elektrontranszportot (Liu és mtsai, 2009, Allahverdiyeva és mtsai, 2013).
10. ábra A hosszan tartó sötétség hatása vad típusú (Col-0) A. thaliana növények, valamint Asc-hiányos vtc2-4, valamint psbr és psbo1 mutánsok klorofill-a fluoreszcencia (OJIP) tranzienseire. (A) A Col-0 és a mutáns növények OJIP tranziensei normál növekedési körülmények között. (B) A Col-0 és a mutáns növények OJIP tranziensei 24 órás sötétkezelés után. (C) A Col-0, vtc2-4, psbr és psbo1 mutánsok változó fluoreszcencia (FV) értékei normál növekedési fényviszonyok között vagy 24 órás sötétkezelést követően.
(D) A maximális fluoreszcencia-intenzitás eléréséhez szükséges idő (TFM érték, ms-ban).
A hosszan tartó sötétség a fotoszintetikus elektrontranszportra gyakorolt hatását klorofill-a fluoreszcencia segítségével vizsgáltuk. Négy napos sötétkezelés alatt az FV/FM érték igen jelentős mértékben, kb. 0.4-re csökkent (Függelék: Podmaniczki és mtsai, 2021). Az FM (P) érték csökkenése mellett már egy napos sötétkezelés után megfigyelhető a K lépés megjelenése, amely a vízbontó komplex inaktivációját jelzi (Srivastava és mtsai, 1997; Tóth és
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.01 1 100 10000 0
500 1000 1500 2000 2500 3000
0.01 1 100 10000
0 500 1000 1500 2000
Fény Sötét
0 1000 2000 3000
Fény Sötét
Kl-afluoreszcencia (r.e.)
Kl-afluoreszcencia (r.e.)
Idő (ms) Idő (ms)
Fény Sötét
FV
Col-0 vtc2-4 psbr psbo1 Col-0 vtc2-4 psbr psbo1
Col -0 vtc2-4 psbo1 psbr
Col -0 vtc2-4 psbo1 psbr A
C D
B
TFM(ms)
mtsai, 2009). Célunk a kezdeti inaktivációs lépések vizsgálata volt, ezért 24 órás sötétkezelést alkalmaztunk a továbbiakban.
Megfigyeltük, hogy a K lépés jóval kevésbé jelenik meg hangsúlyosan a vtc2-4 mutánsban a sötétkezelés hatására, az FV érték kevésbé csökken, valamint az FM érték eléréséhez szükséges idő (TFM) rövidebb, mint a vad típus esetében (10. ábra). A psbo1 mutáns ezzel szemben igen érzékeny volt a sötétkezelésre, a fluoreszcencia kinetikájában nagyon erősen megjelent a K lépés, valamint az elektrontranszport valamelyest tovább lassult a fényben tartott kontrollhoz képest. A psbr mutáns J lépése viszonylag magas, ami a korábban leírt QA-QB elektrontranszport lassulásnak köszönhető (Liu és mtsai, 2009, Allahverdiyeva és mtsai, 2013), sötétben pedig a vad típushoz hasonló mértékű változások következtek be (10.
ábra).
11. ábra 24 órás sötétkezelés hatása a vad típusú Col-0, az Asc-hiányos vtc2-4, valamint a psbr és a psbo1 mutánsok A. thaliana növények TL görbéire. (A) Normál fényviszonyok között nevelt (F) és 24 órán keresztül sötétben tartott (S) vad típusú és a mutáns növények levélszegmensein mért TL görbék (L). (B) A vad típusú és a mutáns növények B sávjának maximális intenzitása.
A vízbontó komplex sötétben történő inaktivációját alátámasztandó, termolumineszcencia méréseket végeztünk. A B sáv (S2S3-QB- rekombináció, Ducruet és Vass, 2009) intenzitása kb. 75%-kal csökkent a vad típusban a sötétkezelés hatására, míg a csökkenés mértéke jóval kisebb, mintegy 50%-os volt az Asc-deficiens mutánsban (11. ábra). A psbr mutánsban a csökkenés még erőteljesebb volt, mint a vad típusban, valamint hasonlóan alacsony volt a B sáv intenzitása a psbo1 mutánsban is (11. ábra). Eredményeink tehát bizonyítják, hogy a 24 órás sötétkezelés hatására a vízbontó aktivitás jelentősen lecsökken, amely viszont jóval mérsékeltebb alacsony Asc koncentráció mellett. Ez összhangban van a
0 200 400 600 800 1000
0 20 40 60 80
Hőmérséklet(°C)
Termolumineszcencia (r.e.)
0 500
1000 Fény
Sötét
Rel. B-sáv intenzitás
A
B
Col-0 vtc2-4 psbr psbo1
Col-0 F Col-0 S vtc2-4 F vtc2-4 S psbr F psbr S psbo1 S psbo1 F B-sáv
korábbi in vitro eredményekkel, mely szerint az Asc redukálhatja a Mn-klasztert (Tamura és mtsai, 1990).
Bizonyos másodlagos hatásokat kizárandó, megbizonyosodtunk róla, hogy a 24 órás sötétkezelés alatt nem csökkent a levelek klorofilltartalma, az Asc-tartalma, a különböző fotoszintetikus alegységek (beleértve az OEC külső fehérjéit) sem degradálódtak, valamint a kloroplasztiszok szerkezete is ép maradt (Függelék: Podmaniczki és mtsai, 2021).
Annak vizsgálatára, hogy az Asc nemcsak sötétben, haem a PSBO hiányában normál körülmények között is képes redukálni a Mn-klasztert, kereszteztük a psbo1 és a vtc2-4 mutánst. A dupla homozigóta vonalak azonosítása sikeres volt, valamint a dupla homozigóták fenotípusa hasonló a psbo1 mutánséhoz (Függelék: Podmaniczki és mtsai, 2021). A gyors klorofill-a fluoreszcencia indukció vizsgálatakor viszont felfedeztük, hogy a dupla psbo1 vtc2 mutáns fotoszintetikus fenotípusa enyhébb a szimpla psbo1 mutánshoz képest: az FM érték magasabb, valamint az FM eléréséhez szükséges idő jelentősen rövidebb (Függelék:
Podmaniczki és mtsai, 2021).
Összefoglalás
Eredményeink alapján kijelenthető, hogy az Asc képes inaktiválni a vízbontó komplexet, és ennek megakadályozásában az OEC külső fehérjéinek fontos szerepe van, elsősorban a PSBO-nak. Feltételezhető, hogy sötétkezelés hatására az OEC külső fehérjék kötődése fellazul, vagy akár disszociálódnak is a PSII-ről, amely lehetővé teszi az Asc hozzáférését a Mn-klaszterhez, ezáltal annak redukcióját.
Eredményeink rávilágítanak arra, hogy az Asc negatívan befolyásolhat bizonyos élettani folyamatokat, ezért állhat annak koncentrációja és lokalizációja erős szabályozás alatt a
Eredményeink rávilágítanak arra, hogy az Asc negatívan befolyásolhat bizonyos élettani folyamatokat, ezért állhat annak koncentrációja és lokalizációja erős szabályozás alatt a