Analitikai módszerek

3.3.1. A takarmányminták sav- és peroxidszámának meghatározása

A takarmánykeverékek sav- és peroxidszámát a hatályos magyar szabvány szerint állapítottuk meg (MSZ 6830/11).

3.3.2. A takarmány- és a tojássárgája-minták zsírsavösszetételének meghatározása

A takarmányok zsírtartalmát a Soxhlet-módszer szerint extraháltuk (MSZ 6830-6:1984). A tojássárgája mintákból 1 g-ot 20 ml 2:1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 4 ml 0,9%-os NaCl-oldattal rázótölcsérben alapos rázással homogenizáltunk, majd két órán keresztül állni hagytuk a fázisok szétválásához. A kloroform-PHWDQRORV Ii]LVW V] U SDStURQ 01

619G) és vízmentes Na2SO4-RQ V] UWN PDMG ƒ&-RV Yt]IUG EHQ

nitrogén gáz alatt bepároltuk. A visszamért száraz súlyt a bemért nedves súlyra vonatkoztatva kaptuk meg az összlipidtartalmat (Folch és mtsai,

$ ]VtUVDYDN PHWLOpV]WHUHNNp W|UWpQ iWDODNtWiVD pUGHNpEHQ D

takarmányból vagy a tojássárgájából származó lipidextraktum 0,2 g-ját 10 ml metanol-benzol-kénsav 75:25:4 térfogatarányú elegyével együtt 50

°C-RQ HJ\ Yt]K WpVHV N°C-RQGHQ]iOy HJ\VpJ VHJtWVpJével két órán keresztül

LQNXEiOWXN + WpV XWiQ D] H[WUDNWXPKR] PO DUiQ\~ GLHWLOpWHU -petroléter keveréket és kb. 100 ml telitett NaCl-oldatot adtunk metilnarancs indikátor jelenlétében. Homogenizálás és a két fázis elválása

XWiQ D IHOV Ii]LVW -100 ml NaCl-oldattal mostuk a metilnarancs sárga színének megjelenéséig, amely az extraktum savmentes észterré alakulását jelezte. Ezután az éteres fázist vízmentes Na2SO4-RQ V] UWND

visszamaradt nedvesség eltávolítása céljából. A mintát 40 °C-RVYt]IUG Q

nitrogén gáz jelenlétében szárítottuk. A metilészter elegyet 1 ml átdesztillált n-hexánban oldottuk fel és a gázkromatográfiás meghatározásig –20 °C-on tároltuk.

A zsírsav metilésztereket Carlo Erba HRGC 5300 Mega Series (Carlo Erba Strumentazione SA, Rodano, Olaszország) gázkromatográfon különítettük el Omegawax 320 kapilláris oszlop (30 m hossz x 0,32 mm

EHOV iWPpU P YDVWDJ ILOPUéteg; Supelco katalógus Nr. 24152;

Supelco, Bellefonte, USA) segítségével. A vizsgálat során 200 °C-os termosztát, és 260 °C-RV GHWHNWRUK PpUVpNOHWHW WDUWRWWXQN IHQQ 9LY Ji]NpQW KpOLXPRW DONDOPD]WXQN POSHUF iUDPOiVL VHEHVVpJJHO

Az egyes zsírsavak azonosítása retenciós idejük alapján történt PUFA-2 standard elegy (Supelco katalógus Nr. 4-7015-U; Supelco, Bellefonte, USA) eredményeivel való összehasonlítás alapján. A zsírsavak egymáshoz viszonyított mennyiségét az összes zsírsav tömegszázalékában fejeztük ki. A kísérleti tápok zsírsavösszetételének ismertetése során használt, 1 kg tápra vonatkoztatott zsírsavmennyiségeket a táp glicerintömeggel korrigált nyerszsírtartalmának (0,95 x nyerszsír) és a zsírsavak tömegszázalékos megoszlásának ismeretében számítottuk ki.

3.3.3. A takarmány- és tojássárgája-minták A- és E-vitamin- tartalmának meghatározása

A takarmányok E-vitamin- (természetes tokoferol-tartalomból, valamint a természetes és a hozzáadott tokoferil-DFHWiW KLGUROt]LVpE O V]iUPD]y -tokoferol-tartalom összege) és A-vitamin-tartalmát az MSZ 6830/37-85 illetve 6830/36-85 alapján végeztük. A tojássárgája-minták A- és E-vitamin-tartalmának ( -tokoferol) meghatározására McMurray és mtsai (1980) módszerének módosított változatát használtuk. A homogenizált tojássárgája-mintákból 200-500 mg-ot elszappanosítottunk 2,5 ml 60%-os KOH és 10 ml 5%-os pirogallol hozzáadásával. Az elegyet 70 °C-on

LQNXEiOWXN SHUFLJ /HK OpV XWiQ PO GHV]WLOOiOW YL]HW pV PO

petrolétert adtunk hozzá, majd a mintákat homogenizálás után egy órán keresztül állni hagytuk a fázisok szétválása érdekében. A petroléteres extraktumot 40 °C-on nitrogén gáz segítségével szárítottuk, és mintánként 1 ml metanolban feloldottuk. Az oldatból 10 µl mennyiséget kromatografáltunk HPLC készülékkel (Spectra-Physics), BST Rutin oszlop (10 µP & PP KRVV] [ PP EHOV iWPpU %LR 6HSDUDWLRQ

Technologies, Budapest) alkalmazásával. Mozgó fázisként metanol-víz elegyét (98:2, v/v) használtuk 1 ml/perc átfolyásssal. Az alkalmazott detektor JASCO 82-FP spektrofluorométer volt. Az A-vitamin-tartalom fluorometriás meghatározása 330 nm-es gerjesztési és 510 nm-es emissziós hullámhosszon, míg az E-vitamin meghatározása 292 és 330 nm-en történt. A kalibrálást all-trans-retinol és α-tokoferol metanolos oldatával végeztük.

3.3.4. A tojássárgája-minták oxidatív stabilitásának meghatározása

A tojássárgája oxidaWtY VWDELOLWiViW MHOOHP] 7%$56 pUWpNHN NLIHMH]YH

nmol MDA/g tojássárgája) meghatározását Dorman és mtsai (1995) által ismertetett módszer alapján végeztük. A tojássárgája mintából 0,1 g-ot 0,9 ml 1,15%-os KCl oldatban homogenizáltunk. A homogenizátum 0,5 ml-éhez 1,5 ml 20%-os ecetsavat (pH = 3,5), 1,5 ml 0,8%-os tiobarbitursav oldatot (1,1% Na-dodecyl-szulfátban oldva) és 0,5 ml desztillált vizet adtunk. Homogenizálás után 100 °C-RVYt]IUG EHQSHUFLJLQNXEiOWXN

$]HOHJ\KH]OHK WpVXWiQPLQWiQNpQWPl n-butanolt adtunk, majd újbóli homogenizálás után 1500 fordulat/perc fordulatszámon 10 percig centrifugáltuk. A butanolos fázist butanol vak oldattal szemben 532 nm-en fotometráltuk. A mért értékek MDA-NRQFHQWUiFLyEDQ W|UWpQ

kifejezése érdekében tetraetoxipropán (malonaldehid-bis-dimetil-acetát)

HWDQRORV ROGDWDWiEyO HO iOOtWRWW VWDQGDUG VRU PpUpVL HUHGPpQ\HLW

használtuk fel.

3.3.5. A vérminták egyes paramétereinek meghatározása

A vérplazma glükózkoncentrációját enzimatikus reagens készlettel határoztuk meg (Sigma katalógus, módszer Nr. 315; Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, USA). A módszer a Trinder-reakción alapul, (Trinder, 1969) az eredeti eljárás módosításával. A glükózt víz és oxigén jelenlétében a glükóz-oxidáz glükonsavvá és hidrogén-peroxiddá alakítja.

A hidrogén-peroxid 4-aminoantipyrinnel és p-hidroxibenzén-szulfonáttal

SHUR[LGi] HQ]LP MHOHQOpWpEHQ TXLQRQHLPLQ QHY V]tQHV R[LGiFLyV

termékké alakul. A festék színintenzitása arányos a minta glükóz- koncentrációjával és 505 nm-es abszorbancia maximummal fotometriásan

PpUKHW

A vérplazma trigliceridtartalmának meghatározása szintén enzimatikus-kolorimetriás módszerrel történt (Reanal módszer Nr. 31951-2-99-80; Reanal Finomvegyszergyár Rt., Budapest). Az eljárás során a triglicerideket a lipoprotein-OLSi] KLGUROL]iOMD $ NHOHWNH] JOLFHULQW D

glicerokináz ATP jelenlétében foszfáttá alakítja. A glicerin-3-foszfát oxigén és glicerin-3-glicerin-3-foszfát oxidáz közötti reakcióban

hidrogén-SHUR[LG NpS] GLN DPHO\ D hidrogén-SHUR[LGi] pV V]tQNpS] N MHOHQOpWpEHQ Pár a glükóz esetében ismertetett színes vegyületet hozza létre. E molekula mennyisége arányos a minta trigliceridtartalmával és fotometriásan meghatározható.

A vérplazma együttes VLDL- és LDL-szintjének meghatározását a Griffin és Whitehead (1982) által ismertetett módszer szerint végeztük. A módszer azon alapul, hogy a heparin és a Mg²⁺ szelektíven csapadékot képez a plazma apolipoprotein-B-t tartalmazó lipoproteinjeivel, a VLDL-lel és az LDL-VLDL-lel. A keletkezett csapadék 540 nm-en mért abszorbancia értékei nem számíthatók át koncentráció értékekre, de a minták lipoprotein-WDUWDOPiQDNUHODWtY|VV]HKDVRQOtWiViWOHKHW YpWHV]LN